[发明专利]牛白血病毒快速检测方法

说明书

本发明涉及一种牛白血病毒快速检测方法，该方法直接以血液作为检测样本，不需要进行特殊处理，便于采集、保存和运输；针对牛白血病病毒（BLV）前病毒最为保守的部分LTR设计引物扩增，保证了本方法的准确性和稳定性；本发明基于巢式PCR检测方法，能快速检测血液样品中牛白血病病毒，其灵敏度可检测到1fg的DNA模板，是一般的PCR检测敏性的100倍，为牛白血病的临床诊断提供了快速准确的诊断工具，对牛白血病的流行病学调查及净化的实施具有重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体的说是一种牛白血病毒快速检测方法。

背景技术

牛白血病（Bovine leukemia）是由牛白血病病毒（Bovine leukemia virus, BLV）所引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的一类具有传染性的肿瘤性疾病。本病于1871年首次发现，目前已经遍布世界各养牛国家，给养牛业造成了巨大的经济损失，成为影响世界养牛业发展的重要传染病之一。

牛白血病的传播途径较多，例如分泌物传播、乳源性传播、寄生虫传播、精液和胚胎移植传播，以及血源性传播等等。研究表明本病主要以血源性传播为主。因此在控制本病的传播过程中应该严把血源性传播的关口。

牛白血病病毒（BLV）属于逆转录病毒科（Retroviridae），为单股RNA病毒。病毒在感染宿主细胞后，前病毒（Provirus）以DNA的形式嵌入宿主细胞的染色体基因组中或者以闭合的环状游离存在。末端重复序列（LTR）为前病毒最为保守的部分。病毒在感染后通常为以前病毒的形式存在于宿主细胞的染色体中。这为疫苗的研制和开发带来了难题。因此，至今还没有有效的疫苗可以预防此病，该病的预防措施主要以净化为主。

目前牛白血病的检测方法主要为血清学检测方法，如琼脂扩散试验、补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。由于本病的潜伏期较长，抗体产生较慢，血清学检测方法难以满足本病的净化需求。而目前直接检测抗原的检测技术较少，且费时费力灵敏度欠佳，难以满足本病的净化需求。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，灵敏度高耗时少的PCR检测技术已广泛地应用于动物疾病诊断。因此，将PCR检测技术应用于牛白血病病毒的检测具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种牛白血病毒快速检测方法，该方法基于巢式PCR检测方法，能快速检测血液样品中牛白血病病毒，其灵敏度可检测到1fg的DNA模板，是一般的PCR检测敏性的100倍，可以精准的检测到样品中微量存在的病毒，为牛白血病的检测和净化提供可靠的检测手段。

为解决上述技术问题，本发明的牛白血病毒快速检测方法包括如下步骤：

步骤1）采集发病牛及隐性带毒牛的外周血作为血液样品；

步骤2）利用核酸抽提试剂盒提取血液样品DNA；

步骤3）对血液样品DNA进行巢式PCR检测；

第一重PCR检测引物采用片段大小为399bp的 LTR1-1/ LTR1-2；

第二重PCR的检测引物采用片段大小279bp的LTR2-1/ LTR2-2；

按下列配比建立第一重PCR反应体系：

10×EX Taq缓冲液 5.0μL，

d NTP (2.5M each) 4.0 μL，

MgCL₂(25uM) 4.0 μL，

EX-Taq酶 0.4 μL，

LTR1-1 (25pmol) 0.5 μL，

LTR1-2 (25pmol) 0.5 μL，