[发明专利]从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物

权利要求书

1.从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将胎盘浸泡于75%酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；

(3)将血管剪碎成1~2mm³碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；

(4)加混合酶液消化；该混合酶液是添加了混合酶的PBS缓冲液，混合酶由以下三者组成：0.1~0.3%胶原酶II、0.1~0.2%胶原酶IV、0.05~0.15%脱氧核糖核酸酶I，该混合酶液中还包含0.02~0.05%谷氨酸钠和0.05~0.1%海藻酸钠；

(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；

(6)离心得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心，得到原始的胎盘间充质干细胞，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80%以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和检测；

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(11)建立包含以上步骤(9)细胞鉴定和检测的信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中所述混合酶液中由以下三者组成： 0.2%胶原酶II、0.15%胶原酶IV、0.1%脱氧核糖核酸酶I。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中加混合酶液消化0.5~2h。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中加混合酶液消化1h。

5.根据权利要求1的方法，在步骤(6)中所述离心是以1000~2000rpm离心3~7min。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(6)中所述离心是以1500rpm离心5min。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中接种密度为0.5~2x10⁵/cm²。

8.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中接种密度为1x10⁵/cm²。

9.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述完全培养基其组成为：DMEM-F12+15% FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。

10.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述培养是在37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

11.根据权利要求1的方法，所述混合酶液中还包含0.03%谷氨酸钠和0.075%海藻酸钠。

12.一种在从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，所述消化酶由以下三者组成：0.1~0.3%胶原酶II、0.1~0.2%胶原酶IV、0.05~0.15%脱氧核糖核酸酶I；该消化酶组合物中还包含0.02~0.05%谷氨酸钠和0.05~0.1%海藻酸钠。

13.根据权利要求12的消化酶组合物，所述消化酶由以下三者组成：0.2%胶原酶II、0.15%胶原酶IV、0.1%脱氧核糖核酸酶I。

14.根据权利要求12的消化酶组合物，其中还包含0.03%谷氨酸钠和0.075%海藻酸钠。