[发明专利]一种放线菌天然产物合成基因簇多拷贝整合方法

权利要求书

1.一种用于在放线菌基因组上整合多拷贝基因簇的即插即用型整合系统，其包括：

第一质粒，该质粒上包括：用于整合外源基因簇的多克隆位点MCS；位于MCS上游的链霉菌启动子kasOp*；两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自噬菌体来源整合酶ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段；邻接所述整合基因的第一抗性基因，其选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr；分别位于整合基因及第一抗性基因上下游的上游接头和下游接头；限制性内切酶SpeI和SwaI的酶切位点，所述SpeI和SwaI酶切位点对称地分别位于上游接头和下游接头两端，当用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切后，留下另一种酶切位点SwaI或SpeI；

第二质粒，该质粒上包含：外源基因簇；一种或者两种以上作为整合位点的整合基因，所述整合基因选自ΦC31、ΦBT1、R4、SV1或TG1基因结合attP位点的DNA片段，并且当包含两种以上整合基因时，与第一质粒上的整合基因不相同；邻接整合基因的第二抗性基因，所述抗性基因选自阿普那抗性基因acc(3)IV、卡那抗性基因aphII、硫链丝菌素抗性基因tsr，并且与第一抗性基因不相同；分别位于整合基因和第二抗性基因上下游的上游接头和下游接头；

该整合系统的质粒构建成模块化质粒，这些模块化质粒上包含两种以上的整合基因进行配套，并且不同模块化质粒上包含不同的整合基因，依据抗性标记的不同分为两个系列，每一系列含有11组质粒，其中在阿普那抗性标记acc(3)IV的质粒中，2个质粒含有1套整合系统即ΦC31或ΦBT1整合基因，3个质粒同时含有2套整合系统即ΦC31/ΦBT1、ΦC31/TG1或ΦBT1/TG1整合基因，3个质粒同时含有3套整合系统即ΦC31/ΦBT1/R4、ΦC31/ΦBT1/SV1或ΦC31/ΦBT1/TG1整合基因，3个质粒同时含有4套整合系统即ΦC31/ΦBT1/R4/SV1、ΦC31/ΦBT1/R4/TG1或ΦC31/ΦBT1/SV1/TG1整合基因；在卡那抗性标记aphII的质粒中，2个质粒含有1套整合系统即ΦBT1或SV1整合元件，3个质粒同时含有2套整合系统即ΦBT1/R4、ΦBT1/SV1或SV1/R4整合元件，3个质粒同时含有3套整合系统即SV1/R4/ΦBT1、SV1/R4/ΦC31或SV1/R4/TG1整合元件，3个质粒同时含有4套整合系统即SV1/R4/ΦBT1/ΦC31、SV1/R4/ΦBT1/TG1或SV1/R4/ΦC31/TG1整合元件，

所述模块化质粒通过下述步骤构建：采用CRISPR/Cas9反应体系对第二质粒进行基因编辑，使用Cas9酶去除质粒上的整合基因和第二抗性基因，得到包含外源基因簇和上游接头及下游接头的第一轮无抗性质粒；酶切第一质粒，采用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切去掉整合基因和第一抗性基因，得到包含整合基因、第一抗性基因、上游接头及下游接头的第一轮DNA片段；采用Gibson反应体系将上述第一轮无抗性质粒与第一轮DNA片段组装一起，得到第一轮模块化质粒；

酶切第一轮模块化质粒，采用另一种限制性内切酶SwaI或SpeI酶切去掉整合基因和第一抗性基因，得到包含外源基因簇和上游接头及下游接头的第二轮无抗性质粒；酶切另一种第一质粒，该质粒上的整合基因和抗性基因与第一轮中第一质粒上的整合基因和抗性基因皆不相同，采用一种限制性内切酶SpeI或SwaI酶切去掉整合基因和抗性基因，得到包含整合基因、抗性基因、上游接头及下游接头的第二轮DNA片段；采用Gibson反应体系将上述第二轮无抗性质粒与第二轮DNA片段组装一起，得到第二轮模块化质粒。