[发明专利]一种基因组定点敲除的方法

说明书

本发明公开了一种基因组定点敲除的方法。本发明保护一种基因编辑系统，包括Cas9核酸酶和sgRNA；所述Cas9核酸酶如序列表的序列4所示；所述sgRNA的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第445‑530位所示。敲除效率的提升可能会伴随脱靶效率的增加，本发明通过使用eSpCas9(1.1)+sgRNA(modified)，平衡了这一矛盾，提升敲除效率的同时，不增加脱靶效率甚至是一定程度的降低脱靶效率。

技术领域

本发明涉及一种基因组定点敲除的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-CRISPR-associated protein9)技术的出现和发展，已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein–RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(DSB，dsDNA break)，而后，生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。一般有两种修复机制，一种是非同源末端连接(NHEJ，non-homologous end joining)，一种是同源重组(HDR，homology-directed repair)，通常情况下，NHEJ修复占大多数，通过随机插入或者缺失不同数量的碱基，细胞将断裂的DSB连接起来，引起编码蛋白的氨基酸移码或发生提前终止，从而改变蛋白的结构，影响基因功能，实现基因定点敲除。

为了提高工作效率，降低工作成本，定点敲除效率的提升一直是植物基因组定点敲除的重要技术方向。另一方面，植物中常用的Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)进行基因组编辑时具有一定的脱靶效应，虽然植物不同于动物，在后代可以通过遗传分离去除脱靶位点，但是由于一些潜在的脱靶位点可能是未知的，所以，后代中就很难有目的性的去除。因此，降低脱靶效应也是植物中一直以来的重要技术方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因组定点敲除的方法。

本发明提供了一种基因编辑系统，包括Cas9核酸酶和sgRNA；

所述Cas9核酸酶如序列表的序列4所示；

所述sgRNA的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第445-530位所示。

本发明还保护表达所述基因编辑系统的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌。

表达所述Cas9核酸酶的表达盒具体可为表达盒甲。

当靶序列如表1所示时，表达所述sgRNA的表达盒具体可为表达盒乙。

本发明还保护一种用于基因敲除的重组表达载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲表达所述Cas9核酸酶；所述表达盒乙包括n个元件乙；所述元件乙包括所述的sgRNA和靶序列；所述重组表达载体可靶向n个不同的靶序列进行基因敲除。

所述元件乙还包括pre-tRNA的核苷酸序列；所述pre-tRNA的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第344-420位所示。

所述元件乙自5’端依次为pre-tRNA的核苷酸序列、靶点序列和sgRNA的核苷酸序列。

以上任一所述表达盒甲由启动子甲启动所述Cas9核酸酶的编码基因表达。所述表达盒甲自5’端依次包括启动子甲、所述Cas9核酸酶的编码基因和终止子甲。所述启动子甲具体可为OsUbq3启动子。所述OsUbq3启动子的核苷酸序列如序列表的序列3自5’端第1-1714位所示。所述终止子甲具体可为CaMV35S终止子。所述CaMV35S终止子的核苷酸序列如序列表的序列3自5’端第5999-6193所示。所述Cas9核酸酶的编码基因如序列表的序列3自5’端第1721-5992位所示。所述表达盒甲具体可如序列表的序列3所示。