[发明专利]抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA及其重组过表质粒以及LMH细胞系

权利要求书

1.一种microRNA过表逆转录病毒载体，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：利用pLNHX质粒的基础序列和fpcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列构建pLNCX-pmiRG质粒，设计引物，采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入表达gSmiR30前体DNA序列，获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR30；

所述pLNCX-gSmiR30设计引物为gga-miR-SIRT1-30-F/R，序列如SEQ ID NO:5-6所示；

其中，所述gSmiR30，其序列如SEQ ID NO:1所示，通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”位点作为靶点设计得到；

PCR反应体系：

反应条件：

2.权利要求1所述microRNA过表逆转录病毒载体在制备治疗鸡Sirt1基因表达异常相关疾病药物中的应用。

3.一种低表达Sirt1基因的LMH细胞系，其特征在于，利用过表达权利要求1所述microRNA构建，包括以下步骤：挑选权利要求1所述的microRNA进行病毒包装后，感染LMH细胞系；然后利用G418抗性加压筛选和绿色荧光蛋白检测结合的方法筛选获得Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系；所述G418加压筛选的浓度为1μg/mL，筛选10天后，转接细胞后继续加压筛选，重复3-5次，最终以获得绿色荧光蛋白表达率在98％以上的细胞为重组细胞。