[发明专利]一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法

权利要求书

1.一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、选种与预处理

选择健壮无病的大田栽培的玫瑰植株，移入洁净棚内培养6~8天，以去除杂菌；从植株上剪取当年生的枝条用流动水冲洗干净后，浸入装有5~8mg/L的2,4-D溶液中，4℃低温预处理2~3天；

S2、外植体灭菌与接种

将上述枝条用毛刷蘸取洗衣粉水轻轻刷洗后转入超净工作台进行无菌操作，切取带腋芽茎段作为外植体，先用75%乙醇表面灭菌30s，再用0.1%升汞+3滴吐温20灭菌8min，每次灭菌后均用无菌水冲洗4~5次；最后用复合维生素溶液浸泡10min，滤纸吸去多余水分；用解剖刀将灭菌后的外植体两端接触升汞的部位切去，再切割成1~2cm带有1个腋芽的茎段，按其生长方向接种于培养基A中；

S3、种质保存材料的获取

①避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为21±2℃的避光环境中培养，培养时间为12~15天；

②光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为23±2℃培养室进行光照，光照时间10~12h/天，光照强度为1600~20001x，培养时间为3个月左右，将获得的试管苗作为种质保存材料；培养期间每个月对培养室进行消毒处理；

S4、试管苗干旱应激处理

将步骤S3获得的试管苗置于含有聚乙二醇的液体MS培养基中处理24h，模拟干旱逆境以提高试管苗的抗逆性；

S5、试管苗限制生长保存

将上述处理后的试管苗分割成具有1-3株芽苗的小块，转接至培养基B上，并在培养基表面倒入适量的无菌硅油，然后置于低温、弱光的条件下使试管苗缓慢生长，每14个月继代一次，继代次数最多不超过3次；

S6、试管苗恢复生长

当玫瑰种质需要恢复生长时，将步骤S5中存活的试管苗转接到培养基C上，培养条件控制为温度23±2℃，光照强度2000~2600lx，每天光照12~14h，每培养20~25天继代1次，继代2次；

S7、试管苗生根

将恢复生长的试管苗切成单株转接到半固体生根培养基中，生根培养基成分为 1/2MS（无琼脂）+0.3mg/L NAA+10g/L甘薯泥+3g/L植物凝胶，pH值为5.8；生根培养条件为温度25±2℃、光照强度2800~3200lx、每天光照12~14h，培养24~30天；

S8、驯化移栽

将试管苗转移到室外，在自然光照下先不打开瓶盖炼苗3d，再松开瓶口炼苗2天，然后完全打开瓶盖炼苗2d，最后用镊子将试管苗取出，将根部用1000倍50%多菌灵可湿性粉剂稀释液浸泡10~15min，然后移栽入装有栽培基质的穴盘上，正常进行水、肥、药管理；移栽后温度控制在18~30℃，空气相对湿度控制在75~85%。

2.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S2中培养基A的成分为MS+0.1mg/LGA₃+0.4mg/L激动素+0.3mg/L亚硒酸钠+37mL/L番茄汁+7.8g/L蛋白胨+14g/L香蕉泥+1.5mg/L 天门冬素+0.06 mg/L富马酸糠醇甲酯+2.3mg/L24-表油菜素内酯，pH 值为5.6~6.0。

3.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S4中聚乙二醇的规格为PEG-6000，浓度为20%。

4.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S5中适量的无菌硅油指无菌硅油能完全覆盖培养基，并且高出培养基表面2~3cm。

5.根据权利要求1所述的一种基于组织培养的玫瑰种质保存方法，其特征在于，所述步骤S5中低温、弱光的条件是指温度6~10℃、光照强度600~800lx、每天光照10~12h。