[发明专利]一种基于PCR-RFLP技术鉴定广地龙的方法

说明书

本发明公开了一种基于PCR‑RFLP技术鉴定广地龙的方法。本发明利用COI基因的通用引物进行PCR扩增，得到各蚯蚓品种的线粒体细胞色素氧化酶(COI)基因片段，并对其进行序列测序、对比，通过DNAMAN软件对不同品种蚯蚓COI片段全序列进行限制性内切酶酶切图谱分析，最终筛选到一种限制性核酸内切酶RsaI对PCR产物进行酶切，用2％的琼脂糖凝胶检测PCR产物的酶切结果，通过酶切图谱可以鉴别广地龙与其他品种。本发明操作简单可靠，可为广地龙商品的鉴定提供新的技术手段。

技术领域：

本发明属于中药材资源鉴定技术领域，具体涉及一种基于PCR-RFLP技术鉴定广地龙的方法。

背景技术：

广地龙是钜蚓科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum)的干燥体，主产于广东广西，是中国传统的动物中药材，广地龙类制剂在临床应用广泛。广地龙有多种药理作用，主要有降压、平喘、解热抗炎、抗血栓、抗肿瘤等。地龙在中国民间有着几千年的用药历史，根据中国药典记载，地龙包括广地龙和沪地龙，其中广地龙的质量被认为行业品质最优。中国的蚯蚓品种较多，形态大小因品种差异而不同，加工成中药材后，增加了品种的辨别难度，不同品种其药效差异大。经调查，中药材市场上广地龙商品伪品较多，严重影响了中药材用药的稳定性和安全性，需要建立新的鉴定技术，准确地完成地龙商品的鉴定。

聚合酶链式反应限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)，是以PCR技术为基础，限制性内切酶对扩增产物序列有特异性识别，消化切割成不同大小片段，因扩增目的序列的限制性内切酶酶切图谱不同,从而产生不同长度的DNA条带，以此用于中药材商品鉴定。PCR-RFLP已广泛应用于中药材鉴定中，包括人参、淫羊藿、川贝母、何首乌等。中国药典记载，部分药材已采用PCR-RFLP技术进行真伪鉴定。但有关利用PCR-RFLP技术鉴定蚯蚓品种未见有报道。本发明利用PCR-RFLP技术应用于中药市场的广地龙商品鉴定中，减少市场伪品的混入，为中药材质量提供保障。

发明内容：

本发明的目的是提供一种操作简单可靠的基于PCR-RFLP技术鉴定广地龙的方法。

本发明的基于PCR-RFLP技术鉴定广地龙的方法，包括以下步骤：提取待测蚯蚓样品的基因组DNA作为模板，以COI基因的通用引物HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’和LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’作为引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化后用限制性内切酶RsaI进行酶切，对酶切产物进行电泳检测，若出现3个片段，则待测蚯蚓样品为广地龙。

优选，所述的PCR扩增的反应体系为25μL，包括DNA模板1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTPs 0.5μL，Taq DNA polymerase 1U，10μmol/L的HCO2198与LCO1490引物各0.5μL，余量为水；反应程序为：95℃预变4min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的酶切的酶切反应体系为20μL，包括纯化的PCR产物8μL，10×Buffer 2μL，0.1％ BSA 2μL，限制性内切酶RsaI 0.5μL，余量为水；反应条件为：37℃反应2h，加10×Loading Buffer 2μL结束反应。

本发明利用COI基因通用引物进行PCR扩增，得到各蚯蚓品种的线粒体细胞色素氧化酶(COI)基因片段，并对其进行序列测序、对比，通过DNAMAN软件对不同品种蚯蚓COI片段全序列进行限制性内切酶酶切图谱分析，最终筛选到一种限制性核酸内切酶RsaI对PCR产物进行酶切，用2％的琼脂糖凝胶(含EB)检测PCR产物的酶切结果，通过酶切图谱可以鉴别广地龙与其他品种。本发明操作简单可靠，可为广地龙商品的鉴定提供新的技术手段。

附图说明：