[发明专利]一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒

权利要求书

1.一种基于血液游离核酸的检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、引物、酶和内标，所述引物包括检测MTB靶核苷酸引物和检测内标引物，所述检测MTB靶核苷酸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标是核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的质粒，所述质粒浓度为2×10⁴copies/ml，所述检测内标引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括以下组分：PCR缓冲液、dUTP plus dNTP Mixture和金属阳离子，所述酶由热启动Taq酶和UNG酶构成。

4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括质控品，所述质控品由阳性质控品和阴性质控品组成，所述阳性质控品为含MTB靶核苷酸序列的克隆菌液，克隆菌液中克隆菌浓度为1000cfu/ml，所述MTB靶核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；所述阴性质控品为无菌生理盐水。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测MTB靶核苷酸荧光探针和检测内标荧光探针，所述检测MTB靶核苷酸荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示，检测MTB靶核苷酸荧光探针的5’端标记有荧光基团，检测探针的3’端标记淬灭基团；

所述检测内标荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，检测内标荧光探针的5’端标记有荧光基团，检测内标荧光探针的3’端标记淬灭基团；

荧光基团选自FAM、HEX、VIC、NED、CY5中一种，淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ中一种，检测MTB靶核苷酸荧光探针和检测内标荧光探针的5’端标记有不同的荧光基团。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括杂交膜条和显色液，所述杂交膜条上附着有杂交探针，所述显色液包括连接有第二显色标记物的微球；

检测内标引物的上游引物的5’端还依次连接有C3间臂和第一标签序列，第一标签序列如SEQ ID NO.15所示；检测内标引物的下游引物的5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色；

检测MTB靶核苷酸引物的上游引物的5’端还依次连接有C3间臂和第二标签序列，第二标签序列如SEQ ID NO.16所示；检测MTB靶核苷酸引物的下游引物的5’端还连接有第一显色标记物；

杂交探针包括第一杂交探针和第二杂交探针；第一杂交探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述第一杂交探针与所述第一标签序列互补配对；第二杂交探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述第二杂交探针与所述第二标签序列互补配对。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一显色标记物为生物素，所述第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集显示蓝色的乳胶微球。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维薄和吸水纸，硝酸纤维薄和吸水纸存在重叠，硝酸纤维膜附着有上下间隔的所述第一杂交探针和所述第二杂交探针。