[发明专利]一种提高白藜芦醇累积量的生物方法

说明书

本发明公开了一种含有白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶的基因缺陷型大肠杆菌菌株及其构建方法、提高白藜芦醇含量的方法。本发明提供的白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶构成的重组质粒包括Rgtal，Pc4cl，Ahsts，accBC，PTDH序列和两段合适的载体片段。本发明提供的提高白藜芦醇累积量的生物方法为，将白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶构成的重组质粒，即pCDF‑Rgtal‑Pc4cl‑Ahsts和pACYC‑accBC‑PTDH转化到延胡索酸酶基因缺陷的大肠杆菌菌株ΔfumB，获得工程菌并发酵，经过培养基优化后的白藜芦醇产量可达22.62mg/L，较原始菌株提高了5.73倍。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一株白藜芦醇合成酶系与延胡索酸基因B缺陷型菌株高产白藜芦醇的方法。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一类含有芪类结构的多酚类化合物，又被称为芪三酚，其化学分子式为C₁₄H₁₂O₃，无色针状结晶，易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂中，于1940年首次从毛叶藜芦的根部提取得到。在于很多自然界的植物中，如葡萄、虎杖、花生、桑植等植物当中都存在白藜芦醇，是植物为了保护自身防止被病菌侵害而产生的抗毒物质。白藜芦醇具有预防和治疗动脉粥样硬化，降低血小板聚集，抗病毒等多种生理活性，已被美国，加拿大等国家列为保健品，在中国，白藜芦醇提取物被制成了具有调血脂、抗肿瘤作用的胶囊。

目前白藜芦醇的生产方法主要有溶剂提取法、酶法提取、超临界CO₂萃取、微波萃取、生物发酵法提取等，作为一种近年来出现的方法，生物发酵法具有低耗能，低成本，生产速率快，反应条件温和等优势，而逐渐成为了生产白藜芦醇的主要趋势，但由于白藜芦醇合成酶的酶活较低，生物合成过程中辅因子的缺乏，成为了白藜芦醇高产的限制因素。

近来分子生物学的发展也为研究者从分子水平探究、提高白藜芦醇产量提供了新思路，白藜芦醇合成有三个关键酶基因，分别是酪氨酸裂解酶(TAL)、香豆酰连接酶(4CL)和白藜芦醇合成酶(STS)，三种基因以酪氨酸为底物合成白藜芦醇。丙二酰CoA是白藜芦醇生物合成的主要底物之一，但是由于丙二酰CoA在生物体内合成效率不高成为了提高白藜芦醇产量的主要限制因素，因此通过分子生物学方法通过向细胞内导入表达丙二酰CoA合成酶的质粒，从而使胞内白藜芦醇产量得以提高，其次可以通过增加ATP的合成，使白藜芦醇合成中的关键酶基因4CL的底物转化效率得到提高。

发明内容

本发明的目的在于，提供了白藜芦醇合成通路上的三个关键酶基因及构建重组质粒的方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种乙酰CoA脱羧酶(accBC)及构建重组质粒的方法，其能促进丙二酰CoA合成。

本发明还有一个目的在于，提供一种亚磷酸盐脱氢酶基因(PTDH)及构建重组质粒的方法，其能间接促进ATP合成。

本发明还有一个目的在于，提供一种白藜芦醇合成酶系和accBC、PTDH组合生产白藜芦醇的菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种敲除延胡索酸酶基因(fumB)的方法，用以抑制丙二酰CoA在旁路途径中被消耗。

本发明提供的白藜芦醇合成酶系重组质粒包括Rgtal，Pc4cl和Ahsts基因序列和一个合适的载体片段；

根据本发明的一个优选实例，在白藜芦醇三种基因构成的重组质粒中，Rgtal，Pc4cl和Ahsts编码区置于T7启动子之后。

根据本发明的另一个优选实施例，所述白藜芦醇三种基因构成的重组质粒具有壮观霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。

根据本发明的一个优选实例，所述accBC和PTDH构建在同一蛋白表达质粒中，accBC及PTDH编码区置于T7启动子之后。