[发明专利]一种转基因小鼠基因型的快速鉴定方法

说明书

本发明涉及一种转基因小鼠基因型的快速鉴定方法，包括两种自主研发的裂解液SG1 Buffer和SG2 Buffer，且包括转基因小鼠组织DNA的获取、目标DNA片段扩增及PCR产物凝胶电泳过程。本发明使用自主研发的组织裂解液在95℃水浴或金属浴中消化鼠尾组织5‑10min，迅速释放小鼠组织中的基因组DNA，裂解产物无需抽提和纯化，直接用做PCR扩增的模板，使得转基因小鼠鉴定模板制备的总时间缩短至10‑15min；使用PCR预混合溶液2×PCR Master Mix(With Dye)，并按照本发明方法优化的实验体系和条件，对目标DNA片段进行扩增，然后PCR产物进行凝胶电泳，快速获得鉴定结果。

技术领域

本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种转基因小鼠基因型的快速鉴定方法。

技术背景

转基因动物技术是指通过人工操作的方式，将外源基因整合到动物的基因组内，使该转基因动物能稳定地 将此基因遗传给后代的一种实验技术。进入21世纪以来，生物技术迅猛发展，转基因小鼠的基因修饰技 术线路日趋成熟，又因其与人类亲缘关系较近、饲养成本较低、繁殖周期短的优势，转基因小鼠已成为目 前最常用的构建人类疾病模型的动物模型，广泛应用于生物学、免疫学、制药等领域，并成为了机理探讨、 药物筛选及基因治疗等的重要有力工具。由于转基因小鼠是通过基因修饰的方法获得可稳定遗传的实验模型，在应用转基因小鼠开展科学研究前，通常需要对小鼠的基因型进行鉴定，区分转基因小鼠以及野生型 小鼠。转基因小鼠基因型鉴定，涉及小鼠DNA的获取、目标DNA片段的PCR扩增及DNA凝胶电泳等 过程。

目前传统的DNA提取方法包括酚/氯仿提取法和高盐提取法。这些方法虽然能够获取较高纯度和较高得率 的组织DNA，但存在操作步骤繁琐(需多次离心)、耗时过长(有些操作步骤需过夜处理)、涉及多种 试剂(均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶K等试剂)等不足之处；另外，一些市面现有的组织DNA提取试剂 盒(如Takara、Promega及Vazyme等公司的试剂盒)也需耗费大量收集柱、多种试剂(如裂解液、中和液、 蛋白酶K等)和多次离心，且DNA提取过程(即模板制备)所花时间也至少在45min到数小时之间。上 述问题都在一定程度上增加实验成本(包括试剂成本、耗材成本和人力成本)，从而制约了转基因小鼠基因 型鉴定的工作效率。

发明内容

本发明的目的就是克服现有技术中的上述不足和缺陷，提供一种快速、高效、简易的转基因小鼠基因型的 鉴定方法。本发明自主研发的组织裂解液在95℃水浴或金属浴中消化鼠尾组织5-10min，可迅速释放组织 中的基因组DNA，无需抽提与纯化，裂解产物直接可以用于PCR扩增，极大减少了提取DNA的步骤和 DNA的获取时间，即使得转基因小鼠鉴定模板制备的总时间缩短至10-15min。然后使用PCR预混合溶液 2×PCR Master Mix(WithDye)及本发明方法优化的实验体系和条件，可快速高效的对转基因小鼠进行基因 型鉴定，极大的提高了实验的效率。

本发明的特点和优势是PCR鉴定模板制备的时间仅需10-15min且操作简单，市面上一些的其他试剂盒模 板制备的时间均较长，如Vazyme公司的One step MouseGenotyping Kit，模板制备过程包括加组织裂解液、 涡旋震荡后在55℃水浴中孵育20-30min、孵育完成后将样品置于95℃或者沸水浴中加热5min灭活 Proteinase K、再将裂解产物涡旋震荡充分混匀后12000rpm离心5min，模板制备时间至少在45min以上； 又如Takara公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit Ver.5.0，其组织裂解及DNA纯 化过程涉及加多种试剂、多次静置离心，整个模板制备时间需2小时以上。另外，本发明对不同类型(完 全敲除、条件性敲除、定点敲入、随机敲入等)的转基因小鼠均有非常好的鉴定效果，后面具体鉴定实例 可说明。

本发明所采取的技术方案为：

一种转基因小鼠组织DNA提取及基因型鉴定的方法，包括以下步骤：