[发明专利]基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法

说明书

本发明涉及一种基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法，本发明的Y型DNA结构末端为信号放大过程的启动序列，当microRNA将其拆解后，本来被保护在结构内部的启动序列暴露，引发后续非线性杂交链式反应。具有检测灵敏度高、检测特异性好等优点。

技术领域

本发明属于microRNA检测技术领域，涉及一种基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法。

背景技术

microRNA是一类非编码单链RNA分子，长度大约为22bp，在人体内具有多种复杂的生物调节功能，由于其与多种疾病的发生发展密切相关，因此可以通过检测相应microRNA的含量而辅助诊断疾病的进展。目前用于microRNA诊断的方法主要有RNA印迹法和逆转录PCR，这类传统的方法普遍存在操作过程复杂，易于引入污染致使结果不可控的缺点，极大地限制了microRNA检测在临床上的应用。近年来，生物传感器技术以其操作简便、准确度高的优点逐渐应用于检测领域，相应的microRNA检测技术也层出不穷。

目前的生物传感器技术大多基于选用新型金属离子材料作为基底或者通过对探针的特殊标记来提高检测的灵敏度，但这两种方法均提高了该技术应用的成本，不利于技术的推广。而DNA纳米材料则完全利用DNA构建，其具有远超于其他材料的生物相容性和低廉的价格，并且可以获得同样甚至更好的检测效果。其中Y型DNA是一种制备较为简单的DNA纳米材料，其由三条DNA单链相互杂交组成，结构的稳定性使其在生物检测领域拥有独特的优势。Y型DNA目前在生物检测领域多是通过固定一条链，随后将第二条链与待测靶目标一起加入组成Y型DNA结构从而实现相应信号的改变及获得。这种相对粗糙的方法一方面没有充分发挥该结构在检测特异性方面的优势，另一方面缺少后续的信号放大步骤，难以实现检测的高灵敏度。竞争性的结合方式通过在Y型DNA结构中引入错配碱基，从而当靶目标出现时可以竞争性结合该部分从而拆解Y型DNA结构，随后辅以信号放大机制则可以最大限度地发挥这种DNA结构的优势。然而目前，运用这种方法综合考虑Y型DNA结构特异性和灵敏度两方面的microRNA检测技术目前还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

Y型DNA结构，是由三条部分互补的DNA单链杂交而得，它们的核苷酸序列如下：

H1:5’-TGGATCCGCATGATCTCGGTCTGACTAGTTGATGAAGCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

H2:5’-GTCGAAGTAGTTGATCCATTGCACTTTCATGCGGATCCA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

H3:5’-TCAGACCGAGACAAGTGCAATG-3’，如SEQ ID NO.3所示。

上述Y型DNA结构的制备方法，是将上述三条DNA单链杂交而得，杂交条件为：95℃变性2分钟，65℃变性5分钟，随后降至60℃保持2分钟，然后以1℃/min的速度缓慢降温至20℃。

优选的，所得Y型DNA结构于4℃保存。

基于上述Y型DNA结构的microRNA快速检测方法，包括步骤：

(1)Y型DNA结构的拆解：将Y型DNA结构与microRNA混合，孵育，Y型DNA结构被拆解；

(2)信号放大过程：将S1、S2、A1、A2与拆解后的Y型DNA结构混合孵育，实现信号放大过程；其中，S1是通过S1a和S1b混合反应得到，S2是通过S2a和S2b混合反应得到，S1a、S1b、S2a、S2b、A1、A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～9所示；