[发明专利]一种基于金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性定量分析的方法

权利要求书

1.一种基于金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性定量分析的方法，其特征是步骤如下：

（1）金纳米粒子的合成：利用单宁酸还原氯金酸合成直径为8-12nm的金纳米粒子；

（2）金壳纳米粒子的制备：将步骤（1）制备所得金纳米粒子溶于聚乙烯吡咯烷酮溶液中，再加入硝酸银和抗坏血酸溶液，合成金包银纳米颗粒，然后再加入氯金酸溶液制备金壳纳米粒子；

（3）上转换纳米粒子表面修饰多粘菌素B：首先在上转换纳米粒子表面偶联半胱氨酸，通过氨基-羧基反应，上转换纳米粒子与多粘菌素B相连；

上转换纳米粒子的制备：取上转换纳米粒子UCNP，用浓度为10 mM，pH为7.4的Tris缓冲液稀释100倍后使用；

上转换纳米粒子修饰多粘菌素B：将水溶性UCNP用pH7.4、10mM 的Tris缓冲液，稀释至10 nM；然后加入半胱氨酸Cys，使Cys：UCNP的摩尔浓度比为100：1，室温反应4 h后，用30kDa分子量的超滤管超滤以除去未偶联的Cys；将4mg多粘菌素B溶解在1mL去离子水中，并加入4μL 2.5％戊二醛进行30 min活化，最后，将20 nM的Cys-UCNP溶液与已活化的多粘菌素B在室温反应6 h，通过30kDa分子量超滤将最终产物纯化并储存在4℃下备用；

（4）金壳纳米粒子表面修饰多粘菌素B抗体：通过Au-S键，使步骤（2）所得金壳纳米粒子与多粘菌素B抗体相连；将步骤（2）制备的金壳纳米颗粒浓缩10倍，然后加入多粘菌素B抗体，以多粘菌素B抗体：金壳纳米颗粒摩尔比为100：1的浓度进行修饰；将混合物在室温下反应6h；将修饰后的金壳在6000 rpm离心5min以除去任何过量的多粘菌素B抗体，然后重悬于水中；

（5）金壳-上转换手性二聚体的制备：通过抗原-抗体反应，制备金壳-上转换手性二聚体；

（6）细菌来源和培养条件：取耐药程度分别为4、8、16、20、24mg/mL的五株耐多粘菌素B大肠杆菌菌株；

将单个菌落接种到10mL LB培养基中，并在37℃恒定振荡200rpm下培养过夜；获得指数生长期5×10 ⁷ CFU / mL的细菌，其OD₆₀₀为0.7，然后，通过pH 7.4的PBS缓冲液将细菌稀释到终浓度为1×10 ³ CFU / mL，用于以下实验；

（7）金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性的检测：将步骤（6）培养的不同耐药程度的大肠杆菌与步骤（3）得到的多粘菌素B修饰的上转换纳米粒子共同孵育8 h；加入步骤（4）中的多粘菌素B抗体修饰的金壳，通过抗原-抗体反应，金壳与未结合的上转换纳米粒子结合形成二聚体，产生CD信号；通过细菌膜表面上转换荧光的变化检测耐药程度；

（8）金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性检测的表征，建立标准曲线：将步骤（7）中的细菌进行荧光信号表征，并建立标准曲线；同时，离心去除细菌，将上清进行CD信号表征，建立标准曲线。

2.根据权利要求1所述基于金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性定量分析的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）金纳米粒子的合成：利用单宁酸还原氯金酸合成直径为8-12nm的金纳米粒子，将0.1mL 1%的单宁酸水溶液和80mL 0.0125%的氯金酸水溶液加热至60℃，然后在剧烈搅拌下将单宁酸溶液快速加入到氯金酸溶液中，反应2h，待颜色不变，溶液冷却至室温，然后将溶液储存在4℃备用；

（2）金壳纳米粒子的制备：首先，将步骤（1）制备的金纳米粒子在13000 rpm下离心10min，沉淀浓缩5倍重悬在pH 7.4、10mM的磷酸盐缓冲液中，取1mL加入1μL 10 mM mPEG-SH，M_W = 5000，获得AuNP-PEG；再将其与0.5 mL 1％聚乙烯吡咯烷酮溶液充分混合，然后分别加入40μL 20 mM硝酸银和20μL 0.1 M抗坏血酸溶液，在室温下均匀混合，反应10min后，在6000 rpm下离心5 min，沉淀重悬于1 mL 1％聚乙烯吡咯烷酮溶液中，得到金包银纳米粒子；最后，在上述溶液中加入200μL 10 mM氯金酸溶液，室温下搅拌反应10min，获得金壳纳米颗粒；

（3）上转换纳米粒子表面修饰多粘菌素B：

上转换纳米粒子的制备：取上转换纳米粒子UCNP，用浓度为10 mM，pH为7.4的Tris缓冲液稀释100倍后使用；

上转换纳米粒子修饰多粘菌素B：将水溶性UCNP用pH7.4、10mM 的Tris缓冲液，稀释至10 nM；然后加入半胱氨酸Cys，使Cys：UCNP的摩尔浓度比为100：1，室温反应4 h后，用30kDa分子量的超滤管超滤以除去未偶联的Cys；将4mg多粘菌素B溶解在1mL去离子水中，并加入4μL 2.5％戊二醛进行30 min活化，最后，将20 nM的Cys-UCNP溶液与已活化的多粘菌素B在室温反应6 h，通过30kDa分子量超滤将最终产物纯化并储存在4℃下备用；

（4）金壳纳米粒子表面修饰多粘菌素B抗体：将步骤（2）制备的金壳纳米颗粒浓缩10倍，然后加入多粘菌素B抗体，以多粘菌素B抗体：金壳纳米颗粒摩尔比为100：1的浓度进行修饰；将混合物在室温下反应6h；将修饰后的金壳在6000 rpm离心5min以除去任何过量的多粘菌素B抗体，然后重悬于水中；

（5）金壳-上转换手性二聚体的制备：将纯化的多粘菌素B修饰的UCNP和多粘菌素B抗体修饰的金壳纳米颗粒以1：1的摩尔浓度比在pH 7.4、Tris缓冲液中混合培养2h，再将混合物在4000 rpm下离心10 min并重悬在PBS中备用；

（6）细菌来源和培养条件：取耐药程度分别为4、8、16、20、24mg/mL的五株耐多粘菌素B大肠杆菌菌株；

将固体琼脂平板上的单个菌落接种到10mL LB培养基中，并在37℃恒定振荡200rpm下培养过夜；

获得指数生长期5×10 ⁷ CFU / mL的细菌，其OD₆₀₀为0.7，然后，通过pH 7.4的PBS缓冲液将细菌稀释到终浓度为1×10 ³ CFU/ mL，用于以下实验；

（7）金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性的检测：取1 mL步骤（6）培养的不同耐药程度的大肠杆菌与100μL步骤（3）得到的多粘菌素B修饰的上转换纳米粒子共同孵育8 h，再加入100μL步骤（4）中的多粘菌素B抗体修饰的金壳，混合培养2h后，在2000 rpm下离心5min，沉淀重悬100μL PBS缓冲液中测定上转换荧光，由于耐药程度不同，细菌膜与多粘菌素B亲和力不同，通过细菌膜表面上转换荧光的变化检测耐药程度；

同时，取上清测定CD信号，通过抗原-抗体反应，金壳与未结合的上转换纳米粒子结合形成二聚体，产生CD信号；

（8）金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性检测的表征，建立标准曲线：将步骤（7）中的细菌进行荧光信号表征，并建立标准曲线；

同时，离心去除细菌，将上清进行CD信号表征，建立标准曲线。