[发明专利]一种马铃薯Y病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法

说明书

本发明提供了一种马铃薯Y病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，包括取样、切丝固定、负染色、电镜观察等步骤。整个过程仅用时十几分钟，具有快速、准确、高效等特点。

技术领域

本发明属于植物保护领域，进一步属于植物病毒的鉴定与检测，具体涉及马铃薯Y病毒的原位分离固定负染色电子显微镜诊断方法。

背景技术

马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型成员，是马铃薯的重要病毒病原之一，最早由Smith于1931年记述。PVY主要通过蚜虫传播，至少有25种蚜虫传播PVY，自然寄主仅限于茄科植物。PVY在全球马铃薯产区广泛发生分布，侵染马铃薯大多引起重花叶症状，对产量损失影响大，与马铃薯X病毒（Potato Virus X, PVX）复合侵染时引起重花叶或严重皱缩、植株矮化，引起马铃薯产量的严重损失。

PVY是单分基因组正义RNA病毒，病毒侵染寄主植株后，在细胞内诱导产生大量囊泡，基因组复制、转录、表达和病毒粒体的装配均在运动相关蛋白6K2介导的囊泡内进行。基因组直接编码一条多聚蛋白，随后产生8～10个功能蛋白，其中外壳蛋白位于多聚蛋白的C端，柱状内含体蛋白（CI）参与病毒的细胞间运动。PVY病毒粒体为较刚直的线状，直径平均为11nm，长度平均为730nm。

PVY在马铃薯生产上以种苗、种薯传播为主，带毒种苗、种薯中毒源量积累以及远距离传播导致病害发生日益严重，发生范围不断扩大。马铃薯生产上PVY的防控方法主要是检测筛选应用无病毒种苗、种薯，检测方法以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，通过制备PVY外壳蛋白抗体进行间接检测，灵敏度较低且需要样品量较大。也有应用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测，通过设计外壳蛋白基因引物，从病组织提取RNA为模版进行扩增，灵敏度较高，但是成本较高且耗时较长，而且是间接检测方法。间接检测方法如ELISA的优势是成本低，可用于大量样品检测，其局限是难以避免假阳性反应（或非特异性反应）的问题。常规电子显微镜检测以病组织研磨制样或通过化学沉淀差速离心进行负染色制样，容易破坏病毒粒体结构及难以反映其原位分布或聚集特征，观察结果不易判断。

为此，本发明改进了现有的透射电镜的样品制备方法，提供了一种快速诊断马铃薯Y病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种马铃薯Y病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，所述方法包括如下步骤：

（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；

（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；

（3） 加入固定液固定2~3min；

（4）将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；

（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；

（6）透射电镜上样、观察和拍照；

（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。

附图说明

图1 PVY完整的单个病毒粒体；

图A中，箭头所指为游离散布的病毒粒体（箭头）；图B中，箭头所指为束状聚集的病毒粒体；病毒粒体大小为11nm×625～750nm；Ve为囊泡。

图2 PVY大量粒体集块状聚集；

图A中，单个粒体交叉聚集；图B中，多个粒体呈束状与交叉聚集。