[发明专利]一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法

说明书

本发明涉及一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法，所述自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉在抗皱抗氧化的应用，其应用方法如下：用生理盐水将所述自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉溶解为质量分数为0.5％的溶剂，得到注射液，将所述注射液通过微针注射至真皮深层。外泌体冻干粉的制备方法包含皮肤来源的成纤维细胞的获得、细胞扩增及细胞鉴定、外泌体分离及鉴定、外泌体的冻干四个步骤。本发明采用自体来源的外泌体用于抗皱抗氧化，易于储存和运输，不存在伦理问题，且安全性高，抗皱抗氧化效果好。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，具体涉及一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法。

背景技术

皱纹是由于皮肤真皮层内的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质缺失，无法支撑皮肤的正常架构，皮肤表皮层随之塌陷形成沟壑而形成的。而这几种重要物质，都是由成纤维细胞分泌而来的。也就是说，成纤维细胞是皱纹形成过程中最主要的效应细胞。胶原蛋白占皮肤干重的70-80％，有助于组织的稳定性和结构完整性。大量研究证明，胶原蛋白合成在真皮中的逐渐衰退导致皱纹和老化皮肤的形成，胶原蛋白直接影响皮肤张力，胶原蛋白结构的维持与皮肤的内在老化和光老化过程有关。随着年龄的增长，紫外线，自由基的刺激，导致成纤维细胞合成抗氧化酶能力降低，诱导成纤维细胞调亡，抑制其增殖活性，从而导致胶原蛋白合成降低；并且在皮肤的衰老过程中，成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)增多，而MMP促进胶原及其他基质细胞的降解。

近年来，干细胞在面部整形方面得到广泛应用，如自体成纤维细胞，取自耳后皮肤，通过体外分离、培养、扩增，再局部注射于衰老部位，在治疗后，皮肤厚度弹性明显增加，皮肤真皮层内的胶原蛋白含量也明显增加，从而达到对皱纹的去除，皮肤的修复和美容作用。然而，目前干细胞在皮肤创面修复中，主要是依靠旁分泌的方式来促进皮肤创面的修复，而干细胞本身向受伤部位的移植，分化率很低，而且短暂。另外，干细胞的使用存在储存和运输困难，伦理，突变致瘤，免疫排斥等限制，因此寻找一种同时具有干细胞疗效，又能克服干细胞治疗缺点的方法十分重要。而外泌体作为一种细胞分泌的亚细胞成分，广泛参与细胞之间的交流，可以作为干细胞旁分泌的一种因子来发挥生物学效应，为实现无细胞治疗提供了新的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法，采用自体来源的外泌体用于抗皱抗氧化，易于储存和运输，不存在伦理问题，且安全性高，抗皱抗氧化效果好。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用，所述自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉在抗皱抗氧化的应用，其应用方法如下：用生理盐水将所述自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉溶解为质量分数为0.5％的溶剂，得到注射液，将所述注射液通过微针注射至真皮深层。

所述的自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的制备方法，包含以下步骤：

(1)皮肤来源的成纤维细胞的获得：无菌条件下取耳后微量皮肤，并采用真皮层组织酶消化法处理，将消化所得的细胞及组织接种于培养瓶中，加入适量成纤维细胞无血清基础培养基，置于培养箱内培养，待细胞长满，进行传代；

(2)细胞扩增及细胞鉴定：当所述步骤(1)中细胞铺满培养瓶底部80％以上面积时倒掉培养基，用生理盐水润洗2次后加入消化液，当大部分细胞开始脱壁时，加入生理盐水中止消化，转移至离心管混匀取样计数，500×g 10min离心洗涤2次，以5000个细胞/cm²的密度传代，当细胞达到80％以上的融合时，重复以上操作，以获得足够数量的成纤维细胞，并进行流式检测标志物直到检测合格；