[发明专利]一种比伐芦定的制备方法

权利要求书

1.一种比伐芦定的制备方法，其特征在于，该方法具体步骤为：

(1)采用Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂作为固相载体，加入脱保护剂，脱除树脂上的Fmoc保护基；

(2)将步骤(1)中脱除Fmoc保护基的树脂在活化剂存在下，按比伐芦定序列依次偶联Fmoc保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH或Boc-D-Phe-OH，获得侧链保护的比伐芦定肽树脂：

R₁-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-X-Y-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-树脂

其中，R₁为Fmoc或Boc；

X为Pro-Gly-Gly；

Y为Gly-Gly；

所述Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH的合成步骤为：采用液相合成法，以H-Gly-Gly-OH、Fmoc-Pro-Osu、碳酸钠为原料，1,4-二氧六环、水为溶剂，TLC检测反应，加入Fmoc-Pro-Osu投料倍数的5～8倍乙酸乙酯，萃取浓缩析晶后重结晶，过滤干燥，所述H-Gly-Gly-OH与碳酸钠的摩尔比为1:0.8～1.0，Fmoc-Pro-OSu与双甘肽的摩尔比为1:1.2～1.4；

(3)将步骤(2)得到的侧链保护的比伐芦定肽树脂进行裂解，沉降得比伐芦定粗品；

(4)将步骤(3)中的比伐芦定粗品纯化、冻干，得比伐芦定精品，所述纯化采用反相C18或C8制备柱，流动相A相：50～100mmol/L乙酸铵溶液，B相乙腈，梯度洗脱，进行一步纯化，得到纯度96％以上的一纯合格液；将一纯合格液再采用流动相A相0.01～0.05％TFA/水，B相乙腈，流速600ml/min，梯度洗脱，完成转盐纯化，获到二纯合格液，合格溶液浓缩冻干，得比伐芦定精肽样品。

2.根据权利要求1所述的比伐芦定的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度范围为0.40～0.80mmol/g；所述脱保护剂是20％v/v哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，脱保护试剂用量为6～12倍树脂质量。

3.根据权利要求2所述的比伐芦定的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂替代度范围为0.6～0.7mmol/g，脱保护试剂用量为8～10倍树脂质量。

4.根据权利要求1所述的比伐芦定的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中Fmoc保护氨基酸投料倍数优选合成规模的2.0～3.0倍；活化剂为HOBT/DIC、HOAT/DIC、HBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA中的一种，活化剂投料量为所述树脂的2.2～3.3倍；偶联时间1～5h。

5.根据权利要求1所述的比伐芦定的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，裂解用到的裂解液为90～95％的TFA和苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水、TIS中的一种或几种，裂解液用量为肽树脂质量的6～8倍，裂解反应时间2.0～3.0h。

6.根据权利要求5所述的比伐芦定的制备方法，其特征在于，所述裂解液为TFA/H₂O/TIS/苯甲硫醚。