[发明专利]一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法

说明书

本发明公开了一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)转录组测序；(2)SSR位点检测；(3)引物设计；(4)SSR体系建立与检测。本发明是基于转录组测序获得叶子花SSR引物的方法，该方法填补了叶子花缺乏自身SSR引物的空白，可用SSR标记进行叶子花品种间亲缘关系鉴定、遗传多样性分析和指纹图谱建立等研究，从而为叶子花的分子辅助育种提供理论依据和技术支撑。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体是一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法。

背景技术

叶子花(Bougainvillea spectabilia Willa)系紫茉莉科叶子花属常绿攀援或披散灌木，原产巴西，又名三角梅、勒杜鹃、宝巾花等，叶子花品种丰富，全世界叶子花的原种、栽培种、变种、杂交种数量有300种之多，但绝大多数品种靠芽变或诱变育种等方式获得，且多为无性繁殖，加上叶子花为外来物种，致使品种间的遗传背景和亲缘关系不明确此外，叶子花的品种在不同的地方常常被冠以不同的名字，在生产中误用了混杂、错误或不适当的品种必定会导致生产、销售、观赏等方面的经济价值、实用价值严重损失，甚至涉及到品种知识产权法律纠纷，同时，给科研工作也带来了很大麻烦。

基于转录组测序开发SSR引物具有便捷、高效、准确、成本低廉等优势，SRR分子标记可用于种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析等领域。目前，关于叶子花SSR引物的开发研究还未见报道。本发明通过对叶子花进行转录组测序、SSR位点检测、引物设计、SSR反应体系建立、引物筛选和多态性检测，获得叶子花SSR引物开发的方法，该方法可分析叶子花种质资源遗传多样性和品种间的亲缘关系，为叶子花的分子辅助育种提供理论依据和技术支撑。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明所要解决的技术问题是：提供一种。

本发明的目的是提供一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，对各个步骤进行严格分析筛选，尤其是采用毛细管电泳筛选引物、检测引物多态性，获得了16对具有多态性的SSR引物。

本发明通过以下技术方案达到上述目的，一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，包括如下步骤：

(1)转录组测序：对叶子花的叶片、苞片、嫩梢、花朵等量混合后进行转录组测序；

(2)筛选SSR位点：基于叶子花转录组测序数据，用SSR Hunter1.3寻找微卫星；

(3)引物设计：采用Primer 5进行引物设计与评价，设计引物时设置的主要参数为:GC含量40％～70％，退火温度55～60℃，引物长18～25bp，预期扩增产物长度120～250bp，且无二级结构和二聚体。

(4)SSR体系建立与检测：

从设计的批量引物中挑选引物对进行合成，以24个叶子花品种的基因组DNA为模板，采用PCR程序进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳，对可扩增出特异性条带的引物进行筛选，筛选出多态性的SSR引物。

具体筛选过程为：先从转录组的序列，挑选出微卫星序列，然后先选30条序列进行引物设计和筛选，找到有多态性的引物，之后继续重复这个过程，直到最后得到10对有多态性的SSR引物.

优选的，寻找微卫星的搜索标准为：重复单元长度为2～4bp，重复次数大于等于5次，单核苷酸重复次数大于等于10次；二核苷酸重复次数大于等于6次；三、四、五、六核苷酸重复次数大于等于5次。

优选的，SSR体系建立包括PCR反应体系和PCR反应程序：10μL PCR反应体系中primers(5uM)0.5～0.8μL，10×PCR Buffer 1～1.1μL，dNTP(10mM)0.8～1.2μL，Taq酶(5U/μL)0.10～0.14μL，DNA模板0.8～1.2μL，添加ddH2O至10μL；