[发明专利]集成DEP分离、磁性微球选择性富集和EIS原位检测的细菌芯片及其检测方法

权利要求书

1.利用集成DEP分离、磁性微球选择性富集和EIS原位检测的细菌芯片检测的方法，其特征在于，所述的芯片由集成有微电极阵列（2）的基片（1）和集成有微通道（12）的PDMS盖片（6）键合，所述微通道（12）设有依次连通的进样通道（7）、混合通道（8）、检测区（9）和出样通道（10）；进样通道（7）为两条且与混合通道（8）连通呈“Y”型，两条进样通道（7）的夹角为60~180°，所述进样通道（7）始端分别设有进样口（701），进样通道（7）长度为10~25 mm，宽度为300~1000 μm，深度为50~100 μm；混合通道（8）集成有10~100个呈Tesla构型的微单元（11），总长度为10~100mm；检测区（9）的构型为圆形，直径为1000~5300 μm，深度与进样通道相同；出样通道（10）为直通道，其长度为1~10mm，宽度和深度与进样通道（7）相同，出样通道（10）的末端设有出样口（101）；所述微电极阵列（2）由2~20组叉指电极（3）组成，每组叉指电极（3）由圆弧形的叉指微电极（4）组成，其与检测区（9）的构型和位置相对应，可被完全浸没于检测区（9）内；所述圆弧形叉指微电极（4）的直径为100 ~ 5000 μm，设有10~100个叉指，叉指的长度为200~1000 μm，宽度为10~30μm，厚度为50~200nm，每组叉指电极中相邻叉指的间距为10~30 μm；通过MEMS（micro electro mechanical systems）加工技术制备得到含微通道的SU8阳膜，通过热塑法将材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）与固化剂的混合物浇注到SU8阳膜上，待气泡除完，60~100℃下固化20~60min，将凝固的PDMS从阳膜上剥离，得到带有微通道的PDMS盖片；具体包括以下步骤：

（1）取10~1000 uL细菌菌液从进样通道的一个进样口进样，取10~1000 μL 0.1~1mg/mL糖基化磁性微球的水溶液另一进样口同时进样，进样方式为蠕动泵注射进样或负压进样，细菌菌液和糖基化磁性微球的水溶液流进混合通道充分混合，完成糖基化磁性微球对细菌的标记得到糖基化磁性微球标记的细菌和多余的糖基化磁性微球的混悬液；

（2）所述步骤（1）得到的混悬液进入检测区时，开始DEP（介电泳），电压为2~10V，频率为400 ~ 600 kHz ，DEP时间为1~30min，关停蠕动泵，继续DEP至混合通道流速为0，停止DEP，所述糖基化磁性微球标记的细菌被富集在检测池中的叉指电极间；

（3）停止DEP后，立即切换至EIS检测模式，EIS的交流扰动信号为50 ~ 500 mv，频率为10~50 kHz，记录阻抗信号值Z；

（4）取不同浓度的细菌菌液和糖基化磁性微球溶液重复上述步骤（1）~（3），记录不同细菌浓度的混悬液的信号值Z_n，n ≥ 5，减去空白信号值，得到∆Z_n，以∆Z_n为纵坐标，以混悬液中细菌浓度为横坐标作关系图∆Z -[C] ；

（5）取待测样品X，按步骤（1）~（3）测定信号值Z_x，并按关系图∆Z -[C]得到待测样品混悬液的细菌浓度，然后根据待测样品的进样体积和糖基化磁性微球水溶液的进样体积计算得出待测样品X中细菌浓度；所述糖基化磁性微球是指甘露糖类衍生物修饰的磁性微球。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基片的材料为玻璃、石英、硅或聚合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叉指电极的材料为金、铂、铜、铝或钯，所述叉指电极是采用MEMS加工的磁控溅射技术制备得到。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖基化磁性微球的制备方法为：15~30℃下，取60～6000μL超声后的0.5~2mg/mL的羧基化磁性微球，用磁铁富集羧基化磁性微球，除去上清液，然后加入300~3000μL100~300mmol/L的EDC和300~3000μL 100~300mmol/L的NHS，避光振摇反应30~60min，随后加入300~3000μL 0.2~2mg/mL的新配甘露糖类衍生物，避光振摇40~120min，再加入300~3000μL 1~5%的牛血清蛋白溶液，避光振摇10~120min，停止反应，磁铁富集，去除上清液，缓冲液洗涤，得到糖基化磁性微球。