[发明专利]一种用于降氮的复配菌剂及其应用与制备方法

权利要求书

1.一种用于降氮的复配菌剂，其特征在于，所述的复配菌剂中包含三种菌株；

所述的三种菌株均为革兰氏阳性菌，分别为芽孢杆菌株A号、芽孢杆菌株B号、芽孢杆菌株C号；三种菌株均于2017年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号分别为GDMCC NO.60155、GDMCC NO.60156、GDMCC NO.60158；

所述的芽孢杆菌株A号为Bacillus sp.；其16s rRNA分子的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的芽孢杆菌株B号为Bacillus sp.；其16s rRNA分子的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的芽孢杆菌株C号为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；其16s rRNA分子的基因序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的三种菌株适宜的生长条件为温度25-30℃，pH 7.0-7.5，采用普通LB培养基。

2.一种如权利要求1所述的用于降氮的复配菌剂的应用。

3.如权利要求2所述的用于降氮的复配菌剂的应用，其特征在于，所述的菌剂用于制备降氮制剂；所述的降氮制剂包含芽孢杆菌株A号Bacillus sp.、芽孢杆菌株B号Bacillussp.、芽孢杆菌株C号解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens三种菌株中的任意一种的单独培养物或任意多种的组合培养物。

4.如权利要求3所述的用于降氮的复配菌剂的应用，其特征在于，所述的菌剂用于制备降低生活废水中无机氮值的制剂。

5.如权利要求4所述的用于降氮的复配菌剂的应用，其特征在于，所述的制剂的制备过程中包含对三种菌株的单独培养物进行复配并确定最优效果的复配制剂；所述的最优效果的复配制剂包含芽孢杆菌株A号Bacillus sp.、芽孢杆菌株B号Bacillus sp.、芽孢杆菌株C号解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens三种菌株培养物的组合。

6.一种如权利要求3所述的用于降氮的复配菌剂制备降氮制剂的方法，其特征在于，所述的方法包含：

步骤1，菌种分离培养；

步骤2，菌株鉴定；

步骤3，发酵培养菌株，收集发酵产物，获得单一成分制剂；再将三种菌株进行复配，获得最优效果的复配制剂。

7.如权利要求6所述的用于降氮的复配菌剂制备降氮制剂的方法，其特征在于，所述的步骤1中包含：

步骤1.1、菌种分离培养：选择池塘底泥样品用于细菌的分离和筛选；

步骤1.2、降氮菌株的筛选：在步骤1.1分离培养得到的菌体中挑取单克隆进行培养，筛选具有降氮能力的菌株。

8.如权利要求6所述的用于降氮的复配菌剂制备降氮制剂的方法，其特征在于，所述的步骤2是对步骤1中分离培养得到的阳性菌株进行鉴定，其包含形态学鉴定，以及采用PCR方法对目标菌株进行PCR反应、序列扩增、产物纯化和16s-rRNA测序操作，对待测菌株进行分子鉴定。

9.如权利要求8所述的用于降氮的复配菌剂制备降氮制剂的方法，其特征在于，所述的分子鉴定是对分离的三种菌株提取提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物进行扩增；采用的正向引物序列为5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物序列为5'-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3'；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

10.如权利要求6所述的用于降氮的复配菌剂制备降氮制剂的方法，其特征在于，所述的步骤3中发酵培养的温度为25-30℃，发酵培养的时间为24-36小时；发酵培养的方式采用旋转震荡培养，转速为180-200转/分钟；发酵培养的培养基采用LB液体培养基；步骤3中的将三种菌株进行复配包含将三种菌株进行两两组合以及将三种菌株组合在一起。