[发明专利]珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途

说明书

本发明公开了珠子参β‑香树脂醇合成酶基因Pjβ‑AS的用途，即其在促进三七细胞合成齐墩果烷型皂苷中的应用，所述珠子参β‑香树脂醇合成酶基因Pjβ‑AS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；采用基因克隆获得珠子参（Panax japonicus）β‑香树脂醇合成酶基因（Pjβ‑AS）；构建含有Pjβ‑AS基因的植物表达载体；将上述载体转化根癌农杆菌EHA105，获得含所述基因的根癌农杆菌菌株；用根癌农杆菌菌株转化三七细胞，获得阳性转Pjβ‑AS基因的三七细胞植株，检测转基因三七细胞中主要齐墩果烷型皂苷的种类和含量；采用本发明获得的转基因三七细胞中，隶属于齐墩果烷型皂苷的竹节参皂苷IV和竹节参皂苷IVa的含量分别为0.20 mg/g和0.42 mg/g。

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途，及将珠子参β-香树脂醇合成酶基因转入三七细胞中，可以在三七细胞中合成齐墩果烷型皂苷的方法。

背景技术

三七（Panax notoginseng）为五加科人参属植物，根和根茎入药，是云南省道地药材，亦是“云南白药”的重要成分。三七为传统名贵中草药，具有活血和止血的双重功效，清代药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者”。目前，三七药材均为栽培品，全世界98%的三七原药材产于云南，三七已经成为云南省最重要的药材资源。三七皂苷是三七的主要药用成分，由达玛烷型四环三萜皂苷组成，未发现含有齐墩果烷型皂苷，这与同为人参属药材的珠子参（Panax japonicus）所含皂苷组分有显著差异。

珠子参Panax japonicus根茎入药，其作为药材，始载于《滇南本草》，为历版《中国药典》收载品种。珠子参药材主产于云南，是彝族、白族、纳西族、傈僳族等少数民族的传统用药，具有补肺养阴、祛瘀止痛，止血之功效，临床上应用于气阴两虚，烦热口渴，虚痨咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血等。珠子参皂苷为珠子参的主要活性成分，包括达玛烷型、齐墩果烷型三萜皂苷。目前，已从珠子参根茎及叶中分离出了30多种皂苷成分，主要包括竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷V、人参皂苷R₀、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1等。珠子参所含皂苷组分与同属“人参”、“三七”相比，在成分种类以及各组分含量上均存在明显差异，因其含有大量齐墩果烷型皂苷，导致临床上的特殊用途。

三七和珠子参均为多年生药材，其根入药，需要轮作，栽培的时间成本高，土地利用率低，加之近些年药材需求逐年增加，导致三七、珠子参均出现了不同程度的供需矛盾，药材价格居高不下。鉴于药材人工栽培时间长，而药用皂苷化学合成机理和路线不够清晰等弊端，利用生物工程技术和合成生物学方法来生产药用皂苷逐渐成为研究热点。

目前，植物萜类药物的同源表达已有产业化应用，包括大规模培养人参皂苷；异源表达系统的研究工作也取得了重要进展，如利用代谢工程手段，在大肠杆菌或酵母中实现目标产物或前体物质的积累，包括青蒿素及其前体在酵母中表达，紫杉醇前体在酵母和大肠杆菌中表达以及人参皂苷在酿酒酵母中合成。利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的细胞系，愈来愈受到人们的关注。但目前利用生物学技术在三七细胞中合成齐墩果烷型皂苷的方法尚无报道。