[发明专利]一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法

说明书

一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法，包括步骤：构建含脂肪酶基因mrml的能够表达mRML的工程菌株；培养工程菌株；经诱导表达获得含米黑根毛霉脂肪酶mRML的发酵液；将发酵液离心，取上清，调节pH至7.0，之后置于低温环境中，直至上清液表面出现结冰；向上清液中加入预冷丙酮，静置，弃上清，收集沉淀；风干沉淀，得米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉。本发明的一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法，以50mL发酵液为研究对象，丙酮和发酵液的体积比为2:1，当发酵液pH调到5.0‑7.0，酶活回收率保持在70％以上。当发酵液pH为7.0时，酶回收率最高，获得酶粉的重量为1.373g，酶粉的比活为3367U/g，酶粉的回收率为94.4％，明显优于现有的生产方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体涉及一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法。

背景技术

脂肪酶(E C3.1.1.3)是可以水解三酰甘油的一类酶，可催化多种化学反应如：水解、酯化、转酯化、氨解等，且具有反应条件温和、专一性强、无污染等优点被广泛的应用于食品、医药、化妆品、石油等行业，被称之为第三大工业用酶。酶粉是常用的保存酶的形式之一，具有方便保存、运输和稳定性好等优点。米黑根毛霉脂肪酶是一种1，3位置专一性的脂肪酶，可被用于制备奶味香精、生产生物柴油等多个方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法，包括步骤：

S1：构建含脂肪酶基因mrml的能够表达mRML的工程菌株；

S2：培养工程菌株；

S3：经诱导表达获得含米黑根毛霉脂肪酶mRML的发酵液；

S4：将发酵液离心，取上清，调节pH至7.0，之后置于低温环境中，直至上清液表面出现结冰；

S5：向上清液中加入预冷丙酮，静置，弃上清，收集沉淀；

S6：风干沉淀，得米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉。

优选的，所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母。

优选的，所述步骤S3中的诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％(v/v)。

优选的，所述步骤S4具体包括：将发酵液于4℃，5000rpm条件下离心10min，之后取发酵液上清40体积份置于容器中，调节pH至7.0，将容器放置在-20℃的环境内，直至容器内的液体表面出现结冰。

优选的，所述步骤S5具体包括：向容器中加入8体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置10min，再向容器中缓慢加入72体积份-20℃预冷的丙酮，边加边缓慢搅拌，之后-20℃静置2-3h，将容器中的混合液于8000rpm、4℃条件下离心10min，弃上清，收集沉淀。

本发明的有益效果：本发明的一种生产米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法，以50mL发酵液为研究对象，丙酮和发酵液的体积比为2:1，当发酵液pH调到5.0-7.0，酶活回收率保持在70％以上。当发酵液pH为7.0时，酶回收率最高，获得酶粉的重量为1.373g，酶粉的比活为3367U/g，酶粉的回收率为94.4％，明显优于现有的生产方法。

附图说明

图1 pPICZαA-mrml表达质粒构建流程图；

图2 zα-mRML-X33摇瓶发酵产酶。

具体实施方式：