[发明专利]一种Wnt10aflox/flox小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供了一种新的Wnt10a^flox/flox小鼠构建方法，以及鉴定筛选Wnt10a^flox/flox小鼠和Wnt10a^flox/+小鼠的PCR实验方法涉及的引物序列。本发明的Wnt10a^flox/flox小鼠构建方法用于构建Wnt10a基因的条件性敲除小鼠模型时，会敲除小鼠模型Wnt10a基因第二外显子，导致转录出来的转录本下游开放阅读框架移位，使其基因功能失活，达到基因敲除的实验效果。

技术领域

本发明涉及制作转基因动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备Wnt10a^flox/flox小鼠的方法及应用。

背景技术

人类WNT10A基因定位于2q35，含有4个外显子，可编码含有417个氨基酸的蛋白质。小鼠Wnt10a基因与人类WNT10A基因的相似性高达95％，这为利用小鼠模型研究人类WNT10A的功能奠定了极为有利的条件。Wnt10a作为Wnt家族中的重要配体成员，已被证实激活Wnt/β-catenin经典信号通路。

Wnt/β-catenin信号通路在牙齿形成的各个阶段都十分活跃。在牙齿发育各个时期，牙源上皮和间充质中都可以检测到β-catenin的表达。尽管已有多篇文献报道Wnt/β-catenin信号通路在牙齿发育过程中能够直接或间接地发挥调控作用，但关于Wnt10a在牙齿发育中的功能未完全阐明。

为了更好的研究Wnt10a在小鼠牙齿发育中的功能，人们建立了小鼠模型。2014年，Jie Yang等人首次报道了Wnt10a全基因敲除(Wnt10a-/-)小鼠的表型，该研究报道中所能够的小鼠模型为全基因敲除Wnt10a小鼠，其技术手段为将Wnt10a基因全长进行剪切从而将其敲除，该种小鼠模型缺乏基因敲除的组织特异性，不利于研究Wnt10a基因在不同组织器官中发育过程中的作用及机制。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新的Wnt10a^flox/flox小鼠的构建方法。

一种Wnt10a^flox/flox小鼠的构建方法，包括下述步骤：

(1)利用基因打靶技术在小鼠胚胎干细胞的Wnt10a基因第二外显子序列两端插入loxp序列；

(2)将步骤(1)所述的小鼠胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内，生产出的嵌合体小鼠与野生小鼠交配，筛选出基因型为Wnt10a^flox/+的F1代小鼠；

(3)选择所述步骤(2)筛选的基因型为Wnt10a^flox/+的F1代小鼠合笼交配，生产出F2代小鼠，筛选出基因型为Wnt10a^flox/flox的F2代小鼠。

筛选出基因型为Wnt10a^flox/+的F1代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：

SEQ NO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAA

SEQ NO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC

筛选出基因型为Wnt10a^flox/flox的F2代小鼠的方法为PCR实验方法，用的引物序列为：

SEQ NO.2:TCACTGTCACTCGAGGCAA

SEQ NO.3:TCTCTCTGACCCTAAGGAGC

所述步骤(2)中将胚胎干细胞植入假孕母鼠的子宫内的具体步骤为利用显微注射技术将步骤(1)所述的小鼠胚胎干细胞注射到小鼠3.5天胚胎中，然后植入假孕母鼠的子宫内。