[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用

权利要求书

1.通过敲除phoP构建得到的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用，其中地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP的构建方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因的上游同源臂和下游的同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将phoP基因的上游同源臂和phoP基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

(3)采用XbaI和SacI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切敲除片段；

(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用XbaI和SacI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切敲除片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔphoP；

(6)将敲除质粒T2(2)-ΔphoP转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

(7)将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到phoP基因的上游同源臂或phoP基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(8)挑选phoP基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与phoP基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了phoP基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP；

其中，所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的phoP基因如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的通过敲除phoP构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。

3.根据权利要求2所述的通过敲除phoP构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8～10g/L蛋白胨，3～6g/L酵母浸出粉，7～10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。

4.根据权利要求2所述的通过敲除phoP构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80～100g/L豆粕；15～40g/L玉米淀粉；4～8g/LCaCO₃和0.5～2g/L(NH₄)₂SO₄。