[发明专利]一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用，本发明所构建的菌株可以极大提高了ATB的产量，而且能够降低后续大规模产业化生产的成本。本发明还进一步提供了利用该菌株发酵生产ATB的方法，并优化了SGC培养基，通过添加氨基酸，极大地提高ATB的产量，最高达到893.32mg/L，比原始菌株提高了50倍。而且本发明还公布了该化合物ATB对各种植物病原真菌、卵菌具有高效的拮抗活性。因此ATB具有开发成生物农药防治作物病害的潜力。

技术领域

本发明属于微生物基因工程和发酵技术领域，具体涉及一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用。

背景技术

农作物病害已成为严重危害农业生产的自然灾害之一，在发展中国家甚至造成50％以上的产量损失。化学农药的使用虽取得了不错的治理效果，但随着人们对健康、安全认识的转变，其弊端亦越发突显。生物农药具有高效、安全、不易产生抗药性等优点，结合其他防治手段可作为绿色农业发展的重要选择。多年来，对其产品创制一直是国内外研究的重点和热点。微生物次生代谢产物是应用范围比较广泛的一类生物农药，如井冈霉素、阿维菌素、赤霉素。传统上，革兰氏阳性细菌链霉菌，是公认为生物活性天然产物的主要来源。然而，由于已经开发了几十年，导致从这种微生物中发现的产物重复率太多。因此，迫切需要从未被过度开发的微生物中筛选新的活性物质作为生防制剂。

溶杆菌(Lysobacter)属于变形杆菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gmmaproteobaeteria)、黄单胞菌目(Xanthomonadaceae)、黄单胞科(Xanthomonadaeeae)，由Christensen和Cook在1978年首次提出的。研究表明大多数溶杆菌对植物病原真菌、卵菌、细菌、线虫和绿藻具有突出的拮抗作用，而且这种作用主要归结于其产生的具有生物活性的代谢产物，如来源于L.capsiciSB-K88的黄原菌素能够抑制甜菜腐霉病的发生；L.antibioticus HS124分泌的4-对羟基苯乙酸具有防治疫霉病的活性；来自于L.capsiciAZ78的2,5-环缩二氨酸对辣椒疫霉病和白粉病展示出了防治效果。因此，溶杆菌蕴藏丰富的生物活性物质，是产生生防制剂潜在的新资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用，本发明所构建的菌株可以极大提高了ATB的产量，而且能够降低后续大规模产业化生产的成本。

为了达到上述目的，本发明提供一种高产抗真菌活性物质菌株的的构建方法，将原始菌株L.enzymogenes OH11，敲除目的基因Le5112、Le5113、Le5114、Le5115、Le5116或Le5117中的一个或几个。具体的，本发明可以选择待敲除的目的基因，并参照全基因组信息设计引物，PCR扩增获得目的基因的上下游片段；将目的基因上下游片段与自杀质粒pEX18GM融合，接着通过电转化转入原始菌株，经过两次交换子筛选及PCR测序验证确定目的基因发生突变的菌株。

本发明所述的原始菌株L.enzymogenes OH11为现有已知菌株，由本实验室从辣椒根际土壤中分离得到。

进一步的，敲除目的基因为Le5115或Le5117中的一个或两个。

更进一步，敲除目的基因为Le5115和Le5117。

其中，所述的Le5112基因序列如SEQ ID NO:1所示；

其中，所述的Le5113基因序列如SEQ ID NO:2所示；

其中，所述的Le5114基因序列如SEQ ID NO:3所示；

其中，所述的Le5115基因序列如SEQ ID NO:4所示；

其中，所述的Le5116基因序列如SEQ ID NO:5所示；

其中，所述的Le5117基因序列如SEQ ID NO:6所示。