[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。本发明利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，向PRV的gE编码区引入荧光蛋白的编码序列，成功筛选到阳性重组病毒后再用同样的技术将荧光蛋白基因替换为一段无关序列(长500bp的LysC序列)，形成插入突变，使PRV的gE蛋白表达缺失。本发明利用荧光蛋白从无到有、再从有到无的可视化筛选，简化了筛选程序，提高了重组病毒构建的效率，缩短了实验周期。并通过在猪伪狂犬病毒(PRV)的gE编码区引入插入突变，使制备的重组病毒可用作PRV减毒疫苗的研发，同时该无关序列可以用作免疫毒和野生毒的鉴别诊断。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。

背景技术

公开号为CN106929485A的中国专利申请，公开了伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用。该技术方案中所用到的噬斑筛选技术为盲目筛选，筛选到重组病毒为纯粹概率事件，筛选后经过病毒扩增培养提取基因组进行PCR检测，工作量较大。

公开号为CN104894075A的中国专利申请，公开了CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用。该技术方案利用两种基因编辑技术，前期构建克隆工作繁琐且工作量大。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，克服现有技术中重组病毒筛选和纯化的过程盲目、繁琐、工作量大的缺点，以及使用两套基因编辑技术，思路和操作都较为复杂，工作量较大的缺点，本发明的目的是提供一种仅使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过先后在PRV的gE编码区插入荧光标记序列和无关序列，以实现操作简便、提高筛选效率的目的。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。所述方法用于快速构建一个重组猪伪狂犬病毒，使其结构蛋白gE表达缺失。

所述构建思路如图1所示，所述方法包括如下步骤：

(1)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬病毒基因组gE编码区的特定位置断裂。

(2)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带荧光标记序列的同源重组模板，在断裂位置插入荧光标记序列；

所述荧光标记可以是本领域常用的荧光标记，例如绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP等，本发明以EGFP为例作为示例性说明。

本发明通过加入了荧光标记序列，使得重组成功的病毒会表达EGFP绿色荧光蛋白，在噬斑筛选时只需要挑选有绿色荧光的噬斑直接接种到细胞中进行下一轮纯化即可，该可视化筛选方案大大提高的重组病毒的筛选效率并减少了重组病毒纯化的工作量。

(3)利用噬斑筛选技术，筛选有荧光的噬斑接种到细胞中进行纯化筛选得到荧光序列成功重组的病毒，命名为PRV-EGFP/gE-。

(4)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬重组病毒PRV-EGFP/gE-基因组在步骤(1)相同的位置再次断裂(与第一次断裂使用同样的sgRNA)。

(5)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带无关序列的同源重组模板，在断裂位置插入无关序列。

(6)筛选无荧光的病毒，所得病毒即为gE蛋白表达缺失的重组病毒。

本发明仅利用CRISPR/Cas9单个基因编辑系统，即可完成伪狂犬病毒基因组的重组。重组病毒筛选和纯化过程均为可视化操作，操作简单，工作量小，适合条件有限的实验室采用。本发明通过采用插入突变而不是直接缺失编码区，可以通过PCR鉴定插入序列，而不用检测gE蛋白的表达，为鉴别诊断提供更简便的方法。