[发明专利]基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用

权利要求书

1.一种非疾病的诊断治疗目的的基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法，其特征是，该方法包括：

靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号；所述受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补，所述供体RNA是5’端羟基化的，所述Taqman探针是一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针；由于双链特异性核酸酶DSN只能切割至少15bp的DNA/RNA杂交体中的DNA链，所述供体RNA或受体RNA都不能诱导双链特异性核酸酶DNA对Taqman探针的切割。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：具体的，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，催化5'羟化的供体RNA的磷酸化以产生5'磷酸化的供体RNA，其可以与3'羟化受体RNA连接以形成完整的RNA触发链；RNA触发链与Taqman探针完全互补，形成RNA触发剂/Taqman探针双链体杂交体，Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)特异性割，Taqman探针两端的荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号,释放的RNA触发链可结合新的Taqman探针，开始新一轮切割，循环放大信号；当不存在多核苷酸激酶(PNK)时，5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接，不能切割DNA Taqman探针释放荧光基团，因此不能检测到荧光信号。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，具体的包括以下步骤：

1)制作标准曲线：

将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和供体RNA混合，再分别加入不同质量的多核苷酸激酶，混合均匀进行磷酸化反应，灭活；

灭活后，加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应；

连接反应结束后，加入双链特异性核酸酶(DSN)进行特异性切割反应，反应结束后，测定荧光光谱，得到不同浓度的多核苷酸激酶样品对应的荧光光谱图；

根据不同浓度的多核苷酸激酶样品荧光光谱图在520nm发射波长处的荧光强度绘制标准曲线；

2)取待检测样品，按照步骤1)中的方法进行荧光检测，根据标准曲线得到待检测样品中多核苷酸激酶的浓度。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，磷酸化反应的条件为：35～40℃反应10～60分钟。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是，连接反应的条件为：35～40℃反应40～90分钟；

6.如权利要求3所述的方法，其特征是，特异性切割反应条件为：50～60℃反应10～60分钟。

7.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的试剂盒，其特征是，至少包括以下成分：供体RNA、受体RNA、Taqman探针和双链特异性核酸酶、RNA连接酶；靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号；所述受体RNA与Taqman探针的3’端互补，供体RNA与Taqman探针的5’端互补，受体RNA与供体RNA连接后完整的RNA与Taqman探针完全互补，所述供体RNA是5’端羟基化的，所述Taqman探针是一种猝灭/荧光基团双标记DNA检测探针；由于双链特异性核酸酶DSN只能切割至少15bp的DNA/RNA杂交体中的DNA链，所述供体RNA或受体RNA都不能诱导双链特异性核酸酶DNA对Taqman探针的切割。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征是：还包括1×双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水。

9.权利要求7或8所述的试剂盒在检测多核苷酸激酶中的应用，所述应用非疾病诊断治疗目的。