[发明专利]流行性造血器官坏死病毒（EHNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种流行性造血器官坏死病毒（EHNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到6fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

在世界水产养殖业中，病毒所造成的危害一直都是非常巨大的。其中虹彩病毒的危害比较严重，其危害的分布范围比较广泛，并且鱼类一旦同时感染虹彩病毒和寄生虫，致死率可达90％以上。流行性造血器官坏死病毒(EHNV)是虹彩病毒科蛙病毒属的成员，能引起河鲈，虹鳟等多种鱼类的幼鱼和成鱼出现内脏坏死以致死亡。1986年在澳大利亚首次被发现，会感染坏死鱼的肾脏造血组织、肝脏和脾脏，对鱼的致死率可达100％。对于EHNV的防治尚无特效药，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。

对于病害检测这方面使用方法主要有镜检观察，分子检测和免疫学检测。PCR分子检测方法是最为常用的检测方法，其方法敏感、准确、快速而被广泛应用，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场检测和普及使用。本发明建立了RAA恒温荧光来检测流行性造血器官坏死病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国水产养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供流行性造血器官坏死病毒(EHNV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸的检测试剂盒，包括：流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。