[发明专利]传染性鲑鱼贫血症病毒（ISAV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种传染性鲑鱼贫血症病毒（ISAV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2.72fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种传染性鲑鱼贫血症病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

传染性鲑鱼贫血症病毒(infectious salmon anaemia virus，ISAV)于1984年在挪威首次出现，是一种海洋病毒，主要感染大西洋鲑鱼(Salmo salar)，可引起严重贫血、程度不同的出血和多组织坏死，是大西洋鲑鱼全身性和致死性的传染病。传染性鲑鱼贫血症病毒是一种正粘病毒，直径100～130nm，由8个基因组片段组成。传染性鲑鱼贫血症是世界动物卫生组织(OIE)水生动物疫病名录中的重要疫病之一，主要在欧洲、北美广泛流行，被列入欧共体鱼类健康指令防治的重要病害之一。因此建立快速而准确的ISAV检测方法，对保护我国的水产养殖业具有重要的意义。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)核酸的检测试剂盒，包括：传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述传染性鲑鱼贫血症病毒反向引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、传染性鲑鱼贫血症病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。