[发明专利]鲑鱼甲病毒（SAV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种鲑鱼甲病毒（SAV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到1.93fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

鲑鱼甲病毒((Salmonid alphavirus，SAV)自20世纪90年代末开始流行于爱尔兰、挪威、英国等国家，主要感染大西洋鲑(Salmo salar)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等鲑科鱼类，引起胰腺、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，在鱼类养殖各生长阶段均有爆发。又被称为鲑鱼胰腺病或昏睡病。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。鲑鱼甲病毒隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)的RNA型病毒，，球型(直径55-65nm)，对氯仿敏感，在pH4.0、pH 12.0和60℃时迅速灭活，在氯化铯中的浮力密度为1.20g/mL。

受鲑鱼甲病毒感染的病鱼一般食欲减退、昏睡、眼突、腹水以及粪便拖尾，无法保持在水中的位置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动，但抓捕时会游开，有时出现突然死亡。解剖发现病鱼心脏苍白，肠道空虚，有黄色黏液，体内脂肪很少，有时在幽门盲肠和四周的脂肪出现瘀斑出血；胰腺、心肌和骨骼肌病变是比较主要的症状。

近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于SAV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测SAV的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供鲑鱼甲病毒(SAV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：