[发明专利]一种基于过表达tfox基因的自然感受态的基因编辑方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于过表达tfox基因的自然感受态的基因编辑方法及其应用，所述基因编辑方法将带有tfox基因的质粒转化至弧菌内，诱导弧菌自然感受态后进行基因编辑，其中基因编辑采用重叠延伸PCR的方法插入抗性基因对弧菌的待编辑基因进行编辑。本发明采用过表达诱导自然感受态的关键基因tfox，引起弧菌自然感受态的产生，进而仅通过直接外源添加同源遗传片段达到特定基因编辑的目的。本方法操作简单、原理通用，编辑过程用时短，可以快速将弧菌诱导至自然感受态，并进行需要的基因编辑，具有良好的推广价值。通过本发明的方法诱导的河流弧菌和霍乱弧菌，均处于自然感受态，是良好的外源DNA受体。

技术领域

本发明涉及一种基于过表达tfox基因的自然感受态的基因编辑方法及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

在自然条件下，细菌主动摄取外源DNA，通过同源重组整合入染色体稳定遗传的过程被称作自然转化(natural transformation)。自然转化是细菌中基因水平转移的重要策略之一。通过自然转化，细菌能够获得新的性状以适应外界不同的环境。大量的研究表明自然转化现象在弧菌科细菌中普遍存在，在弧菌的遗传多样性和进化中具有重要的作用。

细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。自然环境中细菌可以吸收外源遗传物质以增加自身对环境的适应性。细菌的感受态有两种类型：一种是自然感受态(Naturalcompetence)，自然感受态细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是人工感受态(Artificial competence)，在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。

感受态细胞就是通过处理使细胞的通透性变大，使外源基因或载体进入感受态细胞，由于细胞膜的流动性，孔洞会被细胞自身修复。人工感受态的形成，需要低温和钙处理，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列，Ca²⁺与膜上的多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA的渗入，外部理化因素促进了感受态的形成。

发生自然转化的前提条件是细菌须处于自然感受状态(natural competence)。现有的自然感受态可以通过电转化和基因工程的方式诱导细菌自然产生。研究表明，多种弧菌属都能够通过诱导关键基因产生自然感受态，转变成自然感受态的细胞具有从外界吸收遗传物质并整合到自身基因组上的功能。因此，关键基因的编辑和表达成为了人工诱导弧菌自然感受态的一种重要方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种基于过表达tfox基因的自然感受态的基因编辑方法及其应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的基于过表达tfox基因的自然感受态的基因编辑方法的技术方案如下：

诱导自然感受态关键基因tfox的基因编辑方法，所述基因编辑方法将带有tfox基因的质粒转化至弧菌内，弧菌基因进行编辑及抗性筛选后得到含有tfox基因片段的弧菌，后通过诱导剂诱导弧菌自然感受态的产生以及相应的弧菌的基因编辑工作，其中基因编辑采用重叠延伸PCR的方法插入抗性基因对弧菌的待编辑基因进行编辑。

优选的，所述重叠延伸PCR法采用Cm抗性基因取代弧菌基因片段。

具体的，所述基因编辑方法包括如下步骤：

a)构建表达质粒：通过双酶切连接的方式构建表达tfox基因的质粒，转入大肠杆菌复制获取表达tfox基因的过表达质粒；

b)转化过表达质粒：将步骤a)中获得的过表达质粒电转化至通过常规技术手段获得的弧菌感受态细胞内，并通过抗性筛选获得阳性菌株；

c)重叠延伸PCR：设计抗性基因特异性引物、待编辑基因上游和下游特异性引物，重叠延伸PCR获得待编辑位点的同源片段；