[发明专利]一种RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，具体公开了一种RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的方法。本发明以甲流病毒的H1基因检测为切入点建立一套以恒温扩增技术为基础的免疫荧光层析技术，可在常温下进行等温扩增，只需将H1基因的特异引物(SEQ ID NO.1‑2所示)分别进行修饰，便可实现1个试剂检测H1甲流亚型的需求。所构建的甲流检测技术平台可应用于口岸甲流快速筛检，控制甲流的传入传出，具有重要的应用推广价值。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的方法。

背景技术

随着经济全球化的不断深入，国际贸易的不断发展，交通工具、货物、人员在国际间的流动日益频繁，国境口岸成为传播传染病及其媒介生物的重要途径。2009年甲流H1N1的流行给全球经济、人群健康造成重大危害，甲流防控经验提示，现有传统快速检测技术已经无法满足国境口岸检疫查验需求，因此亟待开发甲流的快速检测技术方法。

血细胞凝集抑制试验(Hmagglutination inhibition，HI)和神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibition，NI)是当前流感病毒检测的标准方法，可应用与HA和NA的分型。但由于参考血清供应的不足，这两种方法不能在全球被广泛应用，使用性受到一定的限制。而现在分子诊断技术已经成为新型病毒诊断方法的代表。核酸检测方法比传统方法更灵敏，更快速，也允许更广泛的病毒临床标本的检测。

常用的分子诊断技术包括快速抗原检测试验(RDTs)和PCR/RT-PCR技术。

RDTs简单、快速(10-15min)，适合于床旁检测(POCT)。然而，有大量的报道表示，RDTs的灵敏度和特异性均非常有限，并且RDTs的检测结果仍需要RT-PCR进行确认。

聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)是分子诊断的标准技术，其灵敏度高，特异性强。然而，要采用该方法进行检测，需将样本送往区域或中心实验室进行检测，不能随时随地进行检测，这主要是因为该检测方法需要专业的检测人员设备和复杂的操作过程，而且测试时间较长(50-90min)，因此不适合床旁检测(POCT)。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种特异性检测H1甲流亚型的引物，所述特异性引物包括：

正向引物：5’-AGCAAGTTCGTGGCCCAATCATGAAACAAA-3’，

反向引物：5’-TTGCTGAGCTTTGGATATGAATTTCCCTTT-3’。

第二方面，本发明提供一种RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的方法，采用前述引物对待测样品的DNA或RNA进行RPA扩增。

本发明所提供的RPA结合免疫荧光层析特异性检测H1甲流亚型的原理为：将荧光素FITC与生物素分别标记对特定基因特异且不会形成二聚体的引物进行标记，接下来用标记的引物进行RPA扩增，若体系中存在目标序列，将会得到同时携带生物素和FITC的扩增产物，将此扩增产物按一定比例与抗FITC单抗标记的荧光微球进行混合，从而得到同时携带生物素和荧光微球的扩增产物。将该扩增产物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，通过荧光检测仪器检测荧光微球的信号，检测线信号值越大则代表体系中目标基因得浓度越高(图1)。

因此，所述方法具体包括如下步骤：

(1)提取待测样本RNA；