[发明专利]一种基于斑马鱼蛋白生物响应的水环境健康风险评价方法

说明书

本发明公开了一种基于斑马鱼蛋白生物响应的水环境健康风险评价方法。本发明首先进行斑马鱼暴露实验，然后通过液质联用技术同时定量分析斑马鱼体内多种蛋白生物标志物，再以斑马鱼蛋白响应指数对生物标志物响应进行统一量化，从而确定暴露水体的健康风险等级和程度。本发明通过测定水环境介质暴露下斑马鱼体内的多种蛋白生物标志物的差异表达，并将各生物标志物量化整合成斑马鱼蛋白响应指数以定量地表征水环境的健康风险。

技术领域

本发明属于环境监测与风险评估技术领域，涉及一种以蛋白生物效应为指标的水环境健康风险评价方法，尤其涉及一种综合量化水环境介质暴露下斑马鱼(Danio rerio)体内多种蛋白生物标志物的差异表达，并以此定量评估水环境健康风险的方法。

背景技术

水环境是人类生存发展的重要组成部分，然而，自1993年以来，在我国已发生的1000多起重、特大突发环境事件中约53％是水污染事故。与日益严峻的水环境污染风险相比，我国水环境风险的评价能力相对薄弱。健康风险评价起源于20世纪80年代，以风险度作为评价指标，定量评价环境污染对人体健康的危害，估算有害因子引起人体健康危害的概率。目前应用的水环境健康风险评价模型主要是基于污染物浓度的模型，如美国环保署推荐的健康风险评价模型，它的评价对象是水环境中对人类造成健康风险的有毒污染物，即根据污染物的浓度水平及其已有的毒性试验评估不同类型化合物的健康风险。然而，在实际应用中，这类基于污染物浓度指标的健康风险评价方法存在着一定的不足：一、实际应用中往往无法鉴定水环境中的所有污染物；二、并不是所有污染物都具有相应的毒性试验数据；三、无法评估复合效应。正因为受限于这些局限之处，这类水环境健康风险评价模型往往无法综合地反映实际条件下真实的水环境健康风险。因此需要建立一种基于健康指标的水环境健康风险评价方法。

斑马鱼共享了人类70％的蛋白编码基因，体型小，生长周期短，易于饲养，对环境污染的敏感性强而且研究相对成熟，是理想的健康风险评价模式动物。蛋白质是生命功能的执行者，对于一些低浓度甚至是痕量的污染物，蛋白生物标志物可以较早显示响应。因此本发明选择斑马鱼作为动物模型，以蛋白质为生物标志物，建立基于斑马鱼健康指标的水环境健康风险评价方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于斑马鱼蛋白生物响应的水环境健康风险评价方法。本发明通过测定水环境介质暴露下斑马鱼体内的多种蛋白生物标志物的差异表达，并将各生物标志物量化整合成斑马鱼蛋白响应指数以定量地表征水环境的健康风险。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于斑马鱼蛋白生物响应的水环境健康风险评价方法，包括以下步骤：

(1)斑马鱼暴露实验：斑马鱼暴露实验在恒温(28.5±1℃)且恒光照(光：暗时间为14:10h)的条件下进行。暴露分为对照组和实验组，每组放置成年斑马鱼雌雄各10条(雌雄分开暴露)于一个半静态装置内。暴露期间，每天喂食一次，并更换装置内一半的水。暴露结束后，对每条鱼称重后各加1mL超纯水进行匀浆。匀浆液用离心机2500×g离心10min后，取上清液保存于-80℃冰箱内待分析。

(2)液质联用技术同时定量分析斑马鱼体内多种蛋白生物标志物：分析用的是Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，并在前端串联一根VanGuard^TM保护柱(C18柱，2.1mm×50mm，1.7μm)。流动相用二元洗脱液，A路水，B路乙腈，均添加体积浓度为0.1％的氨水，流速为0.3mL/min，进样量为10μL。设置的梯度是0min，5％(体积比，下同)B；4min，25％B；8min，95％B；10min，5％B。质谱使用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)模式。毛细管电压为1.07kV。氮气用作脱溶剂气，气体的温度和流速分别为为350℃和800L/h。氩气为碰撞气。通过分析测定，得到每种蛋白生物标志物(种类见表1)的浓度。