[发明专利]多重检测EGFR基因19外显子多种热点突变试剂盒

说明书

本申请公开了一种多重检测EGFR基因19外显子多种热点突变试剂盒，其包括有针对EGFR基因19外显子上多种热点突变的引物和探针，所述探针为SEQ ID NO.3以及选自SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.23中的至少一种，或为上述探针序列的反向互补序列；所述引物包括内标引物与待检突变引物，内标引物与待检突变引物相同，且内标探针设计在EGFR基因野生型序列的同一待检区域。本发明将引物和辅助探针设计为共用序列，不仅能够减少19del检测体系设计的难度，还可以降低后期反应体系优化和引物探针相互影响的缺陷，增加本方法的实用性，且降低检测试剂成本。

技术领域

本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是涉及一种新型单管高灵敏的多重检测EGFR基因19号外显子多型别突变位点的试剂盒。

背景技术

EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变亚裔人群阳性率要高于高加索人群。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，且突变种类多，常见的缺失突变达到19种左右，因此检测难度很大，目前主要是基于ARMS-PCR或数字化 PCR等建立的检测方法，该类方法整个设计和优化过程繁琐，成本高昂，需要一种更为简单有效的能够实现EGFR基因19号外显子多型别突变位点并列检测方式。

发明内容

基于此，本发明的目的之一为提供一种简单、灵活、灵敏且可定量的多重检测EGFR基因19外显子多种热点突变试剂盒，解决EGFR基因19外显子多种热点突变单管多重检测的难题。

实现上述目的的技术方案如下。

一种多重检测EGFR基因19外显子多种热点突变试剂盒，包括有针对EGFR 基因19外显子上多种热点突变的引物和探针所述探针为SEQ ID NO.3以及选自SEQ ID NO.4—SEQID NO.23中的至少一种，或为上述探针序列的反向互补序列所述引物包括内标引物与待检突变引物，内标引物与待检突变引物相同，且内标探针设计在EGFR基因野生型序列的同一待检区域。

在其中一个实施例中，所述引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

探针SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.23中的任意一种或几种探针均可分别与本试剂盒中的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及探针SEQ ID NO.3检测对应的 EGFR基因19外显子上的热点突变。

本发明的另一目的是提供一种多重检测EGFR基因19外显子多种热点的探针。

一种多重检测EGFR基因19外显子多种热点的探针，所述探针为SEQ ID NO.3以及选自SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.23中的至少一种，或为上述探针序列的反向互补序列。。

本发明充分发挥了PCR扩增技术和核酸侵入反应技术优势，且进一步发展了多重核酸侵入反应技术，具体原理是：通过设计一对PCR引物对EGFR基因19外显子多种热点突变目标区域进行扩增，用以扩增待检靶区域。针对19 外显子多种热点突变较集中的特点，针对性的设计一条共用辅助探针，并分别设计针对每一种热点突变的检测探针，并标记荧光集团和淬灭基团。反应中，辅助探针、检测探针能够与扩增靶标模板退火杂交，形成一个单碱基重叠侵入结构，该结构可被Afu酶特异性识别，从而切割检测探针与模板互补的第一碱基的化学键，产生信号分子。由于设计的检测探针与模板结合部分的Tm值接近反应温度，新的完整的检测探针会再次与模板退火，形成新一轮的切割，从而实现信号分子的扩增，如此实现对目标物的检测。

本发明具有以下有益效果：