[发明专利]一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)免疫：初次免疫将弗氏完全佐剂皮下多点接种BALB/c小鼠,初次免疫21天后再同样注射一次，初次免疫30天后小鼠尾静脉注射NT-BNP蛋白；

(2)脾细胞的制备：取已经免疫的BALB/c小鼠，眼球采血，分离血清，将分离后的血清作为阳性血清，通过颈脱位处死小鼠，将小鼠消毒，在无菌的条件下，取出小鼠脾脏，取出脾细胞，放入含有10ml不完全培养基的平皿，用吸管吹打数次，制成脾细胞悬液，离心机离心，不完全培养基洗涤2次，将脾细胞重悬于10ml不完全培养基中，以不完全培养基调整脾细胞浓度为1×10⁷个/mL；

(3)骨髓瘤细胞的制备：融合前10天复苏骨髓瘤细胞，放入37℃水中融化，融化后离心机离心，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养,融合当天取对数生长期的骨髓瘤细胞，收集于50ml离心管中，用不完全培养基离心洗涤2次，将骨髓瘤细胞重新悬浮于不完全培养基中，用不完全培养基将骨髓瘤细胞稀释为1×10⁶个/mL，培养箱中培养备用；

(4)饲养细胞的制备：细胞融合前2天，通过颈脱位处死未免疫的KM雌性小鼠，酒精消毒，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*10⁵个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用；

(5)细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合于融合管中，加入不完全培养基,充分混匀，离心机离心,弃上清，置于40℃水浴中预热，45s内加入1ml预热至40℃的融合剂进行融合，90s内加预热至37℃的不完全培养基，37℃静置10min,离心机离心,弃去上清，加入5ml HAT培养基，重悬融合细胞，然后补加含饲养细胞的HAT培养基至100ml,混匀，分装到已含有0.1ml饲养细胞的96孔板中，每孔加0.1ml融合细胞,然后将96孔板放置37℃、5％CO₂培养箱中培养,5天时用HAT培养基半换液，10天时用HT培养基半换液，14天时用RPMI-1640培养基全换液，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10时吸出上清供抗体检测；

(6)筛选：将NT-BNP蛋白用包被液稀释至10ug/mL,以50ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每孔加50ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设阳性、阴性和空白对照，37℃孵育1h,洗涤液洗涤1次，拍干，每孔加底物液50ul,37℃反应20min,以2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD值，若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照明确显色，则可用肉眼直接观察结果，显色为阳性孔；

(7)克隆：制备饲养细胞，用含20％血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞悬液，使每毫升HT培养基中含10个杂交瘤细胞，按每毫升HT培养基加入1*10⁵饲养细胞的比例在上述杂交瘤细胞悬液中加入饲养细胞，将加入饲养细胞的杂交瘤细胞分装至96孔板中，每孔量为0.1ml,每孔的杂交瘤细胞为1个，37℃、7.5％湿润培养7天，取上清进行抗体检测，取阳性孔的杂交瘤细胞扩大培养，并冻存，得到NT-BNP单克隆抗体杂交瘤细胞株；

(8)大规模制取单抗：成年BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，10天后小鼠腹腔接种用磷酸缓冲液稀释的NT-BNP单克隆抗体杂交瘤细胞,5天后，采集小鼠腹水，测抗体效价，冻干保存。

2.如权利要求1所述的一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述洗涤液为Ph7.2的磷酸缓冲液。

3.如权利要求1所述的一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述包被液为Ph9.6的碳酸盐缓冲液或Ph8.0的Tris-HCl缓冲液。

4.如权利要求1所述的一种NT-BNP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述封闭液含5％BSA的磷酸缓冲液。