[发明专利]一种河蚬线粒体基因组富集提取及鉴定方法

说明书

本发明提供了河蚬线粒体全基因组DNA的富集、提取以及通过线粒体基因对河蚬进行鉴定的方法。通过本发明提供的富集、提取方法，能够成功地获得河蚬足量的线粒体基因组DNA。本发明根据河蚬线粒体的序列设计nad2‑cox3基因的引物对Mit1，根据cob基因片段设计的引物对Mit2，本发明提供的两对引物对特异性强，能够特异扩增出河蚬的线粒体序列，但对于其他物种的线粒体均扩增不出该基因片段，具有扩增性能好、区分度好、产生副产物少等优点，可以对河蚬进行物种鉴定。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种河蚬线粒体基因组富集提取及鉴定方法，尤其是通过特异性引物对，对河蚬线粒体进行特异鉴定。

背景技术

河蚬(Corbicula sp.)又称蚬子、沙螺、蝲仔等，隶属于瓣鳃纲，真瓣鳃目，蚬科，蚬属。河蚬是一种具有很强环境适应能力的双壳类水生生物，广泛分布于中国、朝鲜、日本和东南亚各国。在我国的内陆水域，河蚬穴居于水底泥土表层，以浮游生物为食，生长快速，繁殖能力也很强，也适合人工养殖。河蚬肉质营养丰富，可以鲜食，也可以入药，具有开胃、明目、利小便等功效，是我国重要的淡水经济水生生物。目前对河蚬的研究工作多集中在环境适应性、生物量和多样性等方面，而对河蚬的分子生物学的研究却相对较少，无论是河蚬的线粒体全基因组还是核基因组的研究都是空白，因此开展更为广泛的分子生物学的研究极其重要。

线粒体(mitochondria)具有独立于核染色体之外的基因组，被认为是“半自主性细胞器”。线粒体基因组一般遵从母系遗传，几乎不发生重组，父本线粒体在受精过程中被降解或在复制的过程中被丢失。由于线粒体基因组小，结构简单、进化速度快等特点使其成为研究物种起源进化和群体遗传分化的重要对象。不同的物种之间，其线粒体基因组的大小和结构在其在生物进化过程中形成了很大的差别，因此线粒体基因组的全序列研究就成了分子系统发育的有力证据。

随着高通量测序技术的突飞猛进，带动了一大批相关科学和技术的发展，大规模的基因组测序将成为科学发展史上的里程碑，成为各个领域生物学研究的基础。线粒体全基因组测序也成为越来越多研究的需求，而线粒体基因组测序首先需要获得具有较高纯度和总量的线粒体DNA。目前提取线粒体DNA的方法有，蛋白酶K法、碱裂解法、各种各样的试剂盒等，但均存在缺点，如获得的线粒体纯度比较低、操作复杂、费用高昂等等。

本发明中采取差速离心对河蚬线粒体进行分离富集，获得足量高纯度的线粒体DNA，弥补其他线粒体DNA提取方法的不足。

目前已经公开的针对河蚬的线粒体研究方法是根据同源物种的保守基因进行部分区域的扩增。比如，针对河蚬线粒体进行COI基因的片段扩增，研究其遗传多样性和种群结构分析。本发明根据线粒体基因组序列设计出两对特异的引物对，能够特异扩增出河蚬线粒体基因片段，能够对河蚬进行分子物种鉴定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中线粒体基因组提取纯度低、总量少，难以达到后续实验的要求的缺陷，提供一种线粒体基因组富集提取及鉴定方法，通过线粒体基因片段的扩增，对物种进行分子生物学的鉴定。

本发明具体技术方案如下：

一种河蚬线粒体基因组富集提取及鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

S1：待鉴定样品差速离心法粗提线粒体，进而从粗提线粒体中提取待鉴定样品的线粒体基因组DNA；

S2：根据河蚬线粒体nad2-cox3基因设计特异性引物对Mit1，根据河蚬线粒体cob基因设计特异性引物对Mit2；

S3：以S1提取的待鉴定样品的线粒体基因组DNA为模板，采用引物对Mit1和/或引物对Mit2进行PCR扩增；

S4：将S3获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序鉴定；