[发明专利]应用AlphaLISA检测登革病毒的方法及对应的组合物、试剂盒

权利要求书

1.AlphaLISA检测方法在检测登革病毒中的应用。

2.一种AlphaLISA检测组合物，其特征在于包括：包被有捕获抗体的受体微珠、生物素标记的检测抗体、包被有链霉亲和素的供体微珠；所述捕获抗体与检测抗体是一对抗登革病毒NS1蛋白的配对抗体。

3.根据权利要求2所述的AlphaLISA检测组合物，其特征在于，所述包被有捕获抗体的受体微珠由以下制作步骤获得：

1-1.用脱盐离心柱对捕获抗体进行去盐纯化处理，调节抗体浓度为1mg/mL；

1-2.向100μL步骤1-1所获得的抗体加入50μL浓度为20mg/mL的AlphaLISA受体微珠悬浮液，随后加入1.25μL的10％的Tween-20，10μL的400mM的NaBH₃CN溶液，用100mM的pH 7.4的Hepes缓冲液补足到200μL终体积，37℃旋转摇荡孵育20小时；

1-3.孵育完成后加入10μL新鲜制备的浓度为65mg/mL的CMO溶液，37℃孵育1小时；

1-4.PBS洗涤离心2～3次，超声震荡重悬受体微珠。

4.根据权利要求3所述的AlphaLISA检测组合物，其特征在于，所述包被有捕获抗体的受体微珠的使用终浓度为10μg/mL。

5.根据权利要求2所述的AlphaLISA检测组合物，其特征在于，所述生物素标记的检测抗体由以下制作步骤获得：

2-1.纯化检测抗体，调节浓度为1mg/mL、pH≥7.0，加入2mg/mL的NHS-ChromaLink-biotin生物素标记试剂溶液，23℃孵育2小时；

2-2.用脱盐离心柱纯化步骤2-1的混合溶液。

6.根据权利要求5所述的AlphaLISA检测组合物，其特征在于，所述生物素标记的检测抗体使用终浓度为5μg/mL。

7.根据权利要求2所述的AlphaLISA检测组合物，其特征在于，所述包被有链霉亲和素的供体微珠的使用终浓度为40μg/mL。

8.一种检测登革病毒的AlphaLISA试剂盒，其特征在于包括如权利要求2～7任一项所述的AlphaLISA检测组合物，以及384孔微孔板、阳性质控品和阴性质控品；所述阳性质控品为含登革病毒NS1蛋白的基质血清，所述阴性质控品为含基础缓冲液的溶液。

9.权利要求8所述检测登革病毒的AlphaLISA试剂盒的使用方法，其特征在于包括步骤：向384孔微孔板加入待检样本或阳性质控品或阴性质控品，然后加入包被有捕获抗体的受体微珠，再添加生物素标记的检测抗体，在23℃孵育30～60分钟后加入包被有链霉亲和素的供体微珠，于暗环境中再孵育20～30分钟，然后检测荧光值。