[发明专利]一种抗狂犬病毒G蛋白的纳米抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种抗狂犬病毒G蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明还提供了所述纳米抗体在制备狂犬病预防和/或治疗药物中的应用。本发明提供的纳米抗体对狂犬病毒G蛋白具有高度特异的识别和结合能力，亲和力常数最高可达1.36E‑10，并能够通过与G蛋白的特异性结合，从而竞争性抑制G蛋白与新生SD大鼠脑神经细胞受体的结合，证明其在预防和/或治疗狂犬病毒感染中能够发挥有效的免疫保护作用，显示其在狂犬病预防和/或治疗药物制备中的良好应用前景。

技术领域

本发明公开了一种抗体，更具体地，本发明公开了一种纳米抗体。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患全球性传染疾病，人和动物一旦发病，几乎100％死亡。WHO推荐，对于狂犬病暴露，尤其严重暴露者应全程注射狂犬疫苗与抗狂犬病抗体。抗血清对预防狂犬病起着至关重要的作用,由于马免疫血清(ERIG)副反应较大,而人源狂犬病免疫球蛋白(HRIG)来源有限，且存在潜在的病原污染与批次间差异等缺点，因此，急需开发用于治疗的人源抗狂犬病单克隆抗体或者人源化基因工程抗体。同时无论是狂犬疫苗生产过程中的滴度检测，还是疫苗免疫后的抗狂犬病中和抗体检测都需要相应的检测抗体。

狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属，是单股负链不分节段的RNA病毒，是引起狂犬病的病原体。根据对世界各地狂犬病毒株的鉴定和病毒基因组中的N基因末端的500个核苷酸的相似百分比的不同分析，将狂犬病病毒分为4个血清型7个基因型。只有血清型1/基因型I称为狂犬病毒，而其他所有的基因型称为狂犬相关病毒。在自然界中的所有基因型都可造成人或动物的死亡。以上这些基因型又进一步合并为2个遗传谱系：其中基因型1、4、5、6和7为遗传谱系I；基因型2和3为遗传谱系II。每个遗传谱系中的病毒在生物特性上有所不同，如致病性、细胞凋亡的诱导、细胞受体识别等。狂犬病毒基因组大小为12Kb，编码5种结构蛋白，从3′到5′端依次为：核蛋白(N)、磷蛋白(P或NS)、基质蛋白(M)和表面糖蛋白(G)、RNA多聚酶(L)。L蛋白在转录过程发挥重要作用；N蛋白是组成病毒粒子的主要部分，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究；M蛋白为特异性抗原；G蛋白是构成病毒表面纤维状刺突的糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与刺激机体免疫应答产生中和抗体中起着关键作用。

在狂犬病毒中，G蛋白是研究最广泛、最深入的蛋白质，它是一种跨膜糖蛋白，存在于病毒包膜表面，以同源三聚体的形式存在，构成病毒表面突起。狂犬病毒G蛋白基因编码区长1575bp，含有一个开放读码框(ORF)，编码含有524或522个氨基酸的糖蛋白前体，其中的前19个氨基酸残基为信号肽，信号肽被切除后，在内质网中经糖基化等修饰，形成由505个氨基酸残基组成的成熟G蛋白。成熟的G蛋白可分为三部分：膜外区，由1-439位氨基酸构成，携带有狂犬病病毒主要的抗原决定位点，并参与受体识别和膜融合的过程；跨膜区，由440-461位22个氨基酸组成连续性疏水区，与G蛋白在病毒脂质双层膜上的固定有关；膜内区，由462-505位氨基酸组成，其羧基末端位于病毒包膜内表面，提供基质蛋白与核蛋白的作用位点。

G蛋白是狂犬病病毒结构蛋白中唯一能诱生宿主产生中和抗体的蛋白。目前己知的抗原位点都位于膜外区，主要有三个：抗原位点Ⅲ、抗原位点Ⅱ和抗原位点Ⅰ，每个抗原位点又有多个抗原表位相互重叠而成。抗原位点Ⅲ大致位于330-357区段，是最重要的抗原区，其中333-338位氨基酸是中和抗体的主要结合部位，而且第333、336、338位氨基酸与抗原性关系最大，虽然它位于短的线性空间内，但仍是一种空间依赖型的抗原位点。抗原位点Ⅱ位于34-200区段，其中主要两个表位在34-42和198-200区段，两者中间通过二硫键连接，是一段典型的空间构象抗原位点。G蛋白抗原性变化经常是因为GⅡ位点上的34-42位、147位、184位和198-200位氨基酸及GⅢ位点上330-340位氨基酸的改变造成的。狂犬病毒G蛋白还存在一个线性中和表位，位于第244-281氨基酸区段内，称为G5，这一位点是G蛋白唯一的一个线性中和抗原位点，虽然免疫原性较弱，但该位点在不同的狂犬病病毒株中是高度保守的。