[发明专利]用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、检测方法及试剂盒

权利要求书

1.用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，包括以下步骤：将用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量PCR，获得检测结果；

其中，所述用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补；

所述阻断剂能与EGFR基因T790M突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增；

所述检测荧光信号基团能与PCR扩增片段结合并发出荧光信号。

2.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，其特征在于，包括1条针对突变位点的引物，其长度为33个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补。

3.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，所述突变下游引物，其长度为24个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。

4.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，其特征在于，所述引物序列包括：

突变位点EGFR(c.2369C>T)

突变上游引物：

TCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGC(SEQ ID NO.1)

突变下游引物：

AATATTGTCTTTGTGTTCCCGGAC(SEQ ID NO.2)。

5.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，其特征在于，所述阻断剂包括：匹配EGFR野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；

其中，所述阻断剂中匹配EGFR野生型基因的核酸序列包括：AGCTCATCACGCAGCTCAT(SEQID NO.3)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法，其特征在于，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO9、SYBR MIX中的一种或多种。

7.用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物，其特征在于，包括突变上游引物和突变下游引物，突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。

8.用于检测人类EGFR基因T790M突变的阻断剂，其特征在于，所述阻断剂能与人类EGFR基因T790M突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增。

9.用于检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、如权利要求8所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的阻断剂，还包括检测荧光信号基团。

10.如权利要求1所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的检测方法、权利要求7所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物和/或权利要求8所述的用于检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒在检测人类EGFR基因突变中的应用，所述应用在突变型基因浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的样品检测人类EGFR基因突变中的应用。