[发明专利]一种羧肽酶B分泌表达的方法在审
| 申请号： | 201811044790.8 | 申请日： | 2018-09-07 |
| 公开（公告）号： | CN109136208A | 公开（公告）日： | 2019-01-04 |
| 发明（设计）人： | 张梁;於瑞梅;辛瑜;顾正华;李由然;丁重阳;石贵阳 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N9/48 | 分类号： | C12N9/48;C12N15/62;C12N15/70 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 何金锦 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组表达载体 分泌表达 培养基 羧肽酶B 制备 大肠杆菌 宿主 核苷酸序列 信号肽OmpA 羧肽酶原B 定点突变 过量表达 破碎细胞 诱导表达 重组蛋白 周质表达 信号肽 中空间 酶切 分泌 回收 转化 改造 | ||
1.一种羧肽酶B分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以信号肽OmpA、PelB、Endoxylanase和OmpT序列为出发序列，分别进行定点突变；
(2)在编码羧肽酶原B的基因序列的N端添加信号肽突变序列，在编码羧肽酶原B的基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，得到核苷酸序列SDB-pCPB-6×His；
(3)将步骤(2)确定的核苷酸序列SDB-pCPB-6×His克隆到载体PTIG-TRX，获得重组表达载体；
(4)将重组表达载体转化至宿主大肠杆菌E.coli BL21并诱导表达pCPB；
(5)酶切上述pCPB并纯化CPB。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽OmpA的第3位密码子C突变成G，信号肽OmpA突变体的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽PelB的第7位密码子T突变成A，第9位密码子C突变成G，信号肽PelB突变体的序如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽Endoxylanase的第4、5、6位密码子T突变成A，信号肽Endoxylanase突变体的序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽OmpT的第7位密码子G突变成C，第8位密码子C突变成G，信号肽OmpT突变体的序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述羧肽酶原B的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述载体PTIG-TRX含有硫氧还蛋白的基因，其具有分子伴侣相类似的功能。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述诱导表达的pCPB通过改造后信号肽的引导可直接分泌到培养基中，不需破壁，实现了胞外可溶性分泌表达。
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