[发明专利]合成黄芩素和野黄芩素的微生物、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种生产黄芩素的方法，其特征在于，包括：

在宿主细胞中引入表达黄酮6-羟化酶以及细胞色素P450氧化还原酶的基因；所述的黄酮6-羟化酶是经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶是野生型酶或经改造的突变型酶，其野生型酶的氨基酸序列如SEQID NO: 7所示，其突变型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞；

在含有白杨素的培养体系中培养该重组的宿主细胞，从而生产黄芩素。

2.一种将白杨素转化为黄芩素的方法，其特征在于，以黄酮6-羟化酶以及细胞色素P450氧化还原酶催化白杨素，从而在白杨素的结构中加上一个羟基，生成黄芩素；所述的黄酮6-羟化酶是经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶是野生型酶或经改造的突变型酶，其野生型酶的氨基酸序列如SEQID NO: 7所示，其突变型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

3. 一种重组宿主细胞在生产黄芩素中的应用，所述重组宿主细胞中包括外源的表达黄酮6-羟化酶以及细胞色素P450氧化还原酶的基因；所述的黄酮6-羟化酶是经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶是野生型酶或经改造的突变型酶，其野生型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，其突变型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

4. 一种制备用于生产黄芩素的宿主细胞的方法，其特征在于，包括：在宿主细胞中引入表达黄酮6-羟化酶以及细胞色素P450氧化还原酶的基因，获得重组菌株；所述的黄酮6-羟化酶是经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶是野生型酶或经改造的突变型酶，其野生型酶的氨基酸序列如SEQ IDNO: 7所示，其突变型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

5. 一种试剂盒在生产黄芩素中的应用，所述试剂盒中包括重组宿主细胞；所述重组宿主细胞中包括外源的表达黄酮6-羟化酶以及细胞色素P450氧化还原酶的基因；所述的黄酮6-羟化酶是经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶是野生型酶或经改造的突变型酶，其野生型酶的氨基酸序列如SEQ IDNO: 7所示，其突变型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

6. 突变型黄酮6-羟化酶和细胞色素P450氧化还原酶在生产黄芩素中的应用，所述突变型黄酮6-羟化酶为经改造的突变型黄酮6-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；所述细胞色素P450氧化还原酶为野生型或突变型酶，其野生型酶氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其突变型酶氨基酸如SEQ ID NO: 8所示。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述突变型黄酮6-羟化酶和细胞色素P450氧化还原酶形成融合多肽。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将编码所述突变型黄酮6-羟化酶和细胞色素P450氧化还原酶的多核苷酸引入到宿主细胞中，以生产黄芩素；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，制备包含编码所述突变型黄酮6-羟化酶和细胞色素P450氧化还原酶的多核苷酸的表达构建物，引入到宿主细胞中。

10.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生产黄芩素为在白杨素的结构中加上一个羟基，形成黄芩素。