[发明专利]用于检测人类结直肠癌BRAF基因V600E突变的引物、检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了用于检测人类结直肠癌BRAF基因V600E突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与BRAF基因的特异序列结合，扩增突变序列。本发明提供的检测方法采用检测荧光信号基团与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，建立基于实时荧光PCR的试剂盒，可准确检测BRAF基因V600E突变。本发明方法操作简单，结果易读，灵敏度高，能检出含0.001％BRAF基因V600E突变的样本，实现对BRAF基因V600E突变的超灵敏检测。

本申请要求了2017年09月08日提交中国专利局的，申请号为201710806477.2，发明名称为“用于超灵敏检测人类结直肠癌BRAF基因V600E突变的引物、检测方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类结直肠癌BRAF基因V600E突变的引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的，是一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，因其与CRAF和ARAF具有相当高的同源性，故称其为BRAF。BRAF癌基因编码的BRAF蛋白是有丝分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径蛋白，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，在凋亡和增殖过程中起着重要作用，位于MAPK通路入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过 MEK和ERK与核内的转录因子相连接，调节细胞的生长、发育。近来研究发现，人类的许多恶性肿瘤中都有BRAF基因突变，BRAF作为分子标记在多种肿瘤的发生发展中充当着重要角色。调查显示，大约有65％的结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤与该家族中的BRAF突变体有关。BRAF突变后持续性激活MAPK通路，使有丝分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化。

约66％恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中BRAF基因存在体细胞错义突变。大约80-90％的BRAF基因突变发生在exon15的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。目前认为，V600E突变可模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程，从而使得BRAF蛋白异常激活。

当人们发现了这一点后，便开始研发生产出一些能够抑制BRAF突变的药物，并且在临床上应用上取得了重要的成果，比如威罗菲尼片(vemurafenib)，能对那些肿瘤表达原癌基因BRAF的病人起到非常好的效果。另一方面，在临床使用抗BRAF药物之前，进行肿瘤组织中BRAF基因型的鉴定是一件非常重要的事情。对BRAF基因突变进行快速、可靠且经济的检测，可指导肿瘤相关靶向药物的选择、甲状腺癌等分子诊断、为辅助临床医生进行诊断和治疗所需。

目前BRAF基因突变检测的方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，高效液相色谱法，荧光定量PCR法等。其中最常见方法还是测序法，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10％以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR 产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。

若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗，另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA分子的要求。因此，如何快速准确的检测 BRAF基因突变，就成为人们亟待解决的问题。

发明内容