[发明专利]一种混合样本DNA的分析方法

说明书

本发明公开了一种混合样本DNA的分析方法，采用了INDEL+Microhaplotypes的方法分析混合样品DNA，即先利用INDEL的差别化扩增分拣出一个个体的父源或者母源DNA，再利用该DNA分子上的Microhaplotypes进行个体区分；命名为DIP‑Microhaplotypes方法。本发明具有如下有益效果：对于两样本的混合DNA样本的分析、混合斑灵敏度的检测，主要依赖于INDEL，后续SNP的检测则与检测手段有关，可成功分析混合斑，用于排除或者确认个体；INDEL‑SNP引物有种属特异性，适合法医学检测；有可能用于骨髓移植手术或其他器官移植手术后外周血的移植物成分的监测；可能用于所有涉及到混合样本时候需要区分个体的情况。

技术领域

本发明涉及DNA分型技术领域，具体涉及一种混合样本DNA的分析方法。

背景技术

两个或多个个体的混合样本可见于以下情况：(1)法医学混合样本包括多个个体混合 的血样、唾液斑、精斑、阴道分泌物等体液的混合斑；(2)患者进行骨髓移植或者器官移 植以后的外周血样本或者器官等；(3)检测肿瘤患者的早期突变或者肿瘤的异质性；(4)嵌 合体个体或者孕妇的外周血中混合的胎儿样本等等。随着DNA检测技术的发展，DNA混合样 本的检测灵敏度有了很大的提高，但是还不能一一区分构成混合斑中的每一个个体。

检测混合斑的DNA常用技术可大致分为两种策略：(一)首先分离不同类型或不同个体 的细胞，再针对细胞的DNA分型法。如针对含有精斑的混合斑采用二部提取法；分离单细胞 后进行DNA分型法；利用针对某一类细胞的抗体分离细胞后的DNA分型法等。(二)第二个 策略是直接针对提取到的混合样本的DNA进行分型。如(1)直接的STR分析：(2)SNP包括INDEL的直接分析:包括RTPCR技术，测序技术，连接酶分析法等。(3)DIP-STR分析；(4) 测序分析，主要是第二代DNA测序分析等。

上述分析中的不足之处如下：

1、直接的STR分析：STR具有极高的多态性，是法医学DNA分析的主流方法。其主要缺点是：

(1)对于混合斑的分析灵敏度很低，不能检测到构成含量低于5-10％的混合斑；

(2)STR分析由于是属于PCR后的分析，虽然可以分析出优势峰和非优势峰，但是由于PCR 后期的平台效应，使得该方法定量欠准确；

(3)混合斑的DNA使得每一个STR位点产生了多个峰，无法确定其中的个体，一般采用排 除法去排除个体，似然比计算较为复杂。

2、二代DNA测序技术：该技术可以通过软件等链接每一个测得的片段，从何合成分析的序 列。但是该技术有以下缺点：

(1)仪器和试剂等造成方法昂贵且需要专业人员分析，难以普及；

(2)较STR分析而言，该方法可以得到一条DNA链上的所有信息，多态性大大提高，灵敏 度较STR法有所提高(可以检测构成在1％的DNA)，但有一定的错误率，对于法医学分析而 言，尚需要仔细评估。

3、SNP分析，SNP分析技术有很多种，由于单个SNP的多态性远低于STR分析，因此，很少 用直接测序或者电泳的方法检测混合斑；INDEL可以看作之一种特殊的SNP，目前国外已有 相应的试剂盒，除了用于法医学多态性分析外，还用于分析骨髓移植后的外周血DNA的构成， 但未见法医学混合斑的分析。由于采用了差别化扩增技术，该方法具有较高的灵敏度，可以 检测到构成比大于0.1-0.01％的混合斑样本。但是由于该方法只用到了INDEL,无法用到其连 锁的多态性信息，使得该分析的效率低下，需要>20-30个以上的INDEL位点进行分析。尚未 见到该方法对于法医学常见混合斑的分析和参数。