[发明专利]基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞

说明书

本发明公开了一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞，本发明利用电穿孔的方法将靶向MSTN基因的Cas9真核表达载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现对鲁西黄牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶，获得MSTN位点定点敲入FABP4基因和MSTN基因点突变的牛胎儿成纤维细胞。通过Junction PCR筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为供核细胞移入去核的牛卵母细胞中，可获得转基因克隆胚胎，为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供坚实基础。

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞。

背景技术

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)又称生长分化因子8(growthdifferentiation factor 8，GDF-8)，是转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族的成员。MSTN是骨骼肌生长发育的负调控因子，抑制其活性会导致肌肉过度生长和提高胴体瘦肉率。MSTN基因失活是引起肉牛产生双肌表型的分子原因，例如，比利时蓝牛和皮埃蒙特牛。与野生型小鼠相比，MSTN基因纯合突变小鼠的体重增加30％以上，并且其肌肉纤维具有更大的横截面(肥大)以及更多数量的肌纤维(增生)。以上研究结果表明，MSTN基因可以作为促进家畜肌肉生长以及改善肉品质的理想靶标。

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipose fatty acid-binding protein，FABP4)，又称A-FABP、aP2，属于低分子细胞内脂质结合蛋白超家族成员，在长链脂肪酸的摄取、转运以及能量代谢和炎症反应中起着重要的调控作用。FABP4在成熟脂肪细胞中高度表达，约占脂肪细胞内可溶蛋白的6％。已有研究表明，FABP4与脂质代谢紊乱、糖尿病和肥胖相关。在脂肪细胞分化过程中，FABP4的表达量会升高，并且其活性受长链脂肪酸、氧化型低密度脂蛋白、过氧化物酶体增殖激活受体γ以及胰岛素调控。FABP4作为一种脂质蛋白伴侣，对长链脂肪酸具有高亲和力，促进其在细胞内的溶解和转运。因此，FABP4影响脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化，调节体内能量平衡和脂质信号转导。FABP4不仅能够将脂肪酸携带至脂滴储存，或线粒体和过氧化物酶体中进行氧化反应，还能将脂肪酸转运至内质网和细胞核以调控转录、脂质介导的信号转导以及调节酶活性和生物膜的合成。

研究证明MSTN对骨骼肌的生长发育具有负调控作用，该基因的功能缺失能够引起肉用动物的“双肌”表型。但是，具有“双肌”表型的动物肌内脂肪含量较低，严重影响肉的品质。FABP4对脂肪酸有高度的亲和性，参与长链脂肪酸在脂肪细胞中的转运。国内外研究表明，FABP4是影响牛肉嫩度和肌内脂肪含量的候选基因之一，与牛肉品质密切相关。

鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，前躯发育良好，但是后躯发育较差。目前利用基因编辑技术生产优良性状转基因家畜，多是针对单一基因进行编辑，例如，MSTN基因敲除牛、β-乳球蛋白基因敲除牛、fat-1转基因牛等，为获得优质肉用家畜品种，仍需要探索快速、高效的育种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：