[发明专利]一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

试剂一，PH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液60 mL×2瓶，4℃保存；

试剂二，0.05﹪的谷氨酰胺水溶液40 mL×1瓶，4℃保存；

试剂三，20﹪的TCA水溶液60 mL×1瓶，常温保存；

试剂四，茚三酮粉剂×1瓶，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，其特征在于：每瓶所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液均由0.1795g Na₂HPO₄、0.0347g柠檬酸和60mL蒸馏水混合而成，并置于60mL的容量瓶中。

3.根据权利要求1所述的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述谷氨酰胺水溶液由0.02g谷氨酰胺和40mL蒸馏水混合而成，并置于40mL的容量瓶中。

4.根据权利要求1所述的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述TCA水溶液由12g TCA和60mL蒸馏水混合而成，并置于60mL容量瓶中。

5.根据权利要求1所述的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定试剂盒，其特征在于：所述茚三酮粉剂包含0.025g茚三酮，并置于5mL棕色瓶中。

6.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于微量法的谷氨酰胺酶活性测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备台式离心机、可见分光光度计或酶标仪、微量石英比色皿或96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水；

步骤2 粗酶液提取；

1）细菌、细胞样品的制备：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照一定比例加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

组织样品的制备：

先称取组织；然后按照一定的比例加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

3）血清或血浆样品：直接检测；

步骤3 将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零；

步骤4 试剂四在临用前，加入5mL蒸馏水充分溶解混匀，配制成茚三酮水溶液；

步骤5样本测定；

取2支EP管，分别设定为第一测定管和第一对照管；

2）在第一测定管中加入25μL样本、100μL试剂一和400μL试剂二，同时在第一对照管中加入25μL蒸馏水、100μL试剂一和400μL试剂二；

3）分别将第一测定管和第一对照管混匀，37℃水浴1小时；

4）水浴后分别在第一测定管和第一对照管中加入525μL试剂三；

5）分别将上述加入试剂三的第一测定管和第一对照管混匀，并在离心率8000g，25℃下离心10min，取上清液；

6）另取2支EP管，分别设定为为第二测定管和第二对照管；

7）在第二测定管中加入250μL第一测定管中的上清液和50μL试剂四的水溶液，同时在第二对照管中加入250μL第一对照管中的上清液和50μL试剂四的水溶液；

8）分别将第二测定管和第二对照管混匀，90℃水浴20min，并流水冷却；

9）在上述冷却后的第二测定管和第二对照管中各取200μL混合溶液至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波长处分别记录测定管的吸光值A_测定管和对照管的吸光值A_对照管；

10）计算ΔA=A_测定管-A_对照管；

步骤5 酶活性的计算；

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0074x - 0.5255；

其中，x为标准品浓度，单位为μg/mL；y为吸光值，取值为ΔA；

1）血清或血浆中的GLS活性；

单位定义：每mL血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/mL) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0074×V_反总÷ V_样÷ T = 94.59 × (ΔA +0.5255)；

2）组织、细菌或细胞中的GLS活性；

2.1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/mg prot) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0074 × V_反总÷ (V_样× Cpr) ÷ T =94.59 × (ΔA + 0.5255) ÷ Cpr;

2.2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/g 鲜重) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0074 × V_反总 ÷ (W ×V_样 ÷ V_样总)÷ T = 94.59 × (ΔA + 0.5255) ÷ W；

2.3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/10⁴ cell) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0074 × V_反总 ÷ (500 × V_样 ÷V_样总) ÷ T = 0.189 × (ΔA + 0.5255)；

其中，V_样总表示加入提取液体积，且V_样总=1 mL；

T表示反应时间，且T=60min；

V_反总表示反应体系总体积，且V_反总=1.05mL；

V_样表示加入反应体系中样本体积，且V_样=0.025mL；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示细菌或细胞总数，代表500万个；

b.用96孔板测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0037x - 0.5255；

其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；

1）血清或血浆中的GLS活性；

单位定义：每mL血清或血浆每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/mL) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0037 × V_反总 ÷ V_样÷ T = 189.19 ×(ΔA + 0.5255)；

2）组织、细菌或细胞中的GLS活性；

2.1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/mg prot) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0037 × V_反总 ÷ (V_样× Cpr) ÷ T= 189.19 × (ΔA + 0.5255) ÷ Cpr;

2.2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/g 鲜重) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0037 × V_反总 ÷ (W ×V_样 ÷ V_样总)÷ T = 189.19 × (ΔA + 0.5255) ÷ W；

2.3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1μg谷氨酸定义为一个酶活力单位；

GLS(μg/min/10⁴ cell) = (ΔA + 0.5255) ÷ 0.0037 × V_反总 ÷ (500 × V_样 ÷V_样总) ÷ T = 0.378 × (ΔA + 0.5255)；

其中，V_样总表示加入提取液体积，且V_样总=1 mL；

T表示反应时间，且T=60min；

V_反总表示反应体系总体积，且V_反总=1.05mL；

V_样表示加入反应体系中样本体积，且V_样=0.025mL；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示细菌或细胞总数，代表500万个。