[发明专利]利用CRISPR-Cas9构建的斑马鱼cip2a基因突变体及其构建方法在审
| 申请号： | 201811032925.9 | 申请日： | 2018-09-05 |
| 公开（公告）号： | CN109082426A | 公开（公告）日： | 2018-12-25 |
| 发明（设计）人： | 吴怡;方芳;李之珩;钱光辉 | 申请（专利权）人： | 苏州大学附属儿童医院 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90;C12Q1/6858;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京林达刘知识产权代理事务所(普通合伙) 11277 | 代理人： | 刘新宇;李茂家 |
| 地址： | 215000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 斑马鱼 靶位点 构建 基因突变体 突变 筛选 遗传 生物技术领域 基因突变 技术构建 突变类型 突变体表 显微注射 验证方式 基因座 突变体 外显子 引物 合成 体内 验证 翻译 基因 | ||
1.一种利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述突变体构建包括如下步骤：
(1)在cip2a基因上选择Cas9靶位点；
(2)分析确认cip2a-Cas9靶位点；
(3)制备Cas9mRNA和cip2a-gRNA；
(4)制备F0斑马鱼并检测cip2a基因靶点突变效率；
(5)检测F0斑马鱼的生殖遗传；
(6)确认F1斑马鱼cip2a基因突变类型；
(7)筛选F2斑马鱼cip2a基因纯合突变体。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的cip2a基因Cas9靶位点设计方法如下：
(1)从Ensemble网站上获取cip2a的蛋白编码序列(CDS)；
(2)运用ZiFiT Targeter Version 4.2网站设计靶位点，打开网站，输入cip2a蛋白编码序列；
(3)设定靶位点长度为20个碱基，靶点3’端的3个碱基构成PAM区，序列为NGG(N为任意碱基)，输出靶位点序列；
(4)cip2a基因的Cas9靶位点序列为：
5’-CCAGTCACGCACTGACCGGGACC-3’，为反义链靶点，位于第2个外显子。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9构建斑马鱼cip2a基因突变体的方法，其特征在于，所述的确认cip2a-Cas9靶位点的方法如下：
(1)在Ensemble网站上比对靶位点序列，比对结果显示靶点是cip2a基因的单一位点；
(2)在靶位点上下游设计引物
5’端引物为，5’-GAGTGCTGTTCTCGGGTCAG-3’，命名为P1，
3’端引物为，5’-ATACCAAATTGTGCCAGCAG-3’，命名为P2，
产物大小为123个碱基对，从野生型斑马鱼基因组中PCR扩增这段序列，其中应包含靶点序列，扩增产物电泳大小符合预期；
(3)将PCR产物进行测序，测序结果和预测靶点序列一致。
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