[发明专利]一种靶向性外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向性外泌体的制备方法，其特征在于：

将PSP1多肽与靶向肽或具有促进免疫功能的短肽共价结合形成PSP1靶向肽后，再与外泌体进行结合，即获得具有靶向性外泌体；

PSP1靶向肽与外泌体进行结合时，包括以下步骤：在外泌体中加入所述PSP1靶向肽进行混合后，采用离心超滤，并用PBS进行冲洗，即得到具有靶向性的外泌体；

所述靶向肽至少包括EGFR靶向肽、nAchR靶向肽和肝癌细胞靶向肽中的一种；

PSP1多肽的氨基酸序列为CLSYYPSYC。

2.根据权利要求1所述的靶向性外泌体的制备方法，其特征在于：所述EGFR靶向肽为GE11多肽；

所述GE11多肽的氨基酸序列为：YHWYGYTPQNVI；

将所述PSP1多肽与所述GE11多肽进行合成，得到PSP1-GE11靶向肽，所述PSP1-GE11靶向肽的氨基酸序列为：CLSYYPSYCYHWYGYTPQNVI。

3.根据权利要求1所述的靶向性外泌体的制备方法，其特征在于：所述nAchR靶向肽为嗜神经性病毒衍生肽，其氨基酸序列为：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG；

将PSP1多肽、嗜神经性病毒衍生肽和6个组氨酸残基进行合成，得到PSP1-RVG29-6His靶向肽；

所述PSP1-RVG29-6His多肽的氨基酸序列为：CLSYYPSYCYTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGHHHHHH。

4.根据权利要求3所述的靶向性外泌体的制备方法，其特征在于，PSP1-RVG29-6His靶向肽的合成的方法包括以下步骤：

步骤a、合成5’端和3’端各含有BamHI、XhoI限制性内切酶酶切位点的DNA序列：5’-ggatccTGCCTGTCCTATTATCCGTCCTATTGCTACACTATTTGGA

TGCCGGAAAATCCGCGTCCGGGTACCCCATGCGACATCTTCACCAACTCCCGTGGTAAACGCGCGTCTAACGGCCACCATCACCACCACCATTAActcgag-3’；

步骤b、将步骤a中的DNA和pGEX-4T-1质粒均采用BamHI和XhoI限制性内切酶，分别进行双酶切后分离纯化；选取需要的目标DNA条带进行切割，并分别提取PSP1-RVG29-6His DNA及pGEX-4T-1线性化质粒；

步骤c、在酶切后提取的pGEX-4T-1线性化质粒进行去磷酸化处理；

步骤d、将酶切后提取的PSP1-RVG29-6His与去磷酸化后的pGEX-4T-1质粒按照5:1的比例进行混合后反应；

步骤e、反应后导入感受态E.coli K12，通过氨苄青霉素的筛选出阳性菌落；

步骤f、将阳性的表达菌落通过PSP1-RVG29-6His的IPTG诱导进行原核表达后收集，破碎收集到的细菌后离心，并收集上清液进行纯化后，即获得GST/PSP1-RVG29-6His多肽；

步骤g、纯化后的GST/PSP1-RVG29-6His多肽用凝血酶进行GST 解离，而后通过分离获得PSP1-RVG29-6His靶向肽。

5.根据权利要求4所述的靶向性外泌体的制备方法，其特征在于：步骤b中，采用BamHI和XhoI限制性在37°C下进行双酶切4h，并采用琼脂糖凝胶电泳分离纯化。

6.根据权利要求4所述的靶向性外泌体的制备方法，其特征在于：步骤c中的去磷酸化处理过程为：

酶切后的pGEX-4T-1线性质粒溶液中加入CIAP和10×CIAP 缓冲剂，并用DDW 补齐至20μL，于37°C 下反应30min后，经DNA纯化。