[发明专利]一种人类阿司匹林抵抗基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类阿司匹林抵抗基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由分别用于扩增与人类阿司匹林抵抗相关的GPIIIa、GP1BA、PEAR1 3个基因多态性的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明所述试剂盒用于检测人类阿司匹林抵抗基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类阿司匹林抵抗基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

阿司匹林是治疗急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入术后抗栓的基础药物，广泛应用于心脑血管疾病一级和二级预防。临床发现部分患者尽管长期低剂量服用阿司匹林仍不能有效抑制血小板的活性，即阿司匹林抵抗，其发生率约50％～60％且存在明显种族差异性。研究表明，GPIIIa、GP1BA和PEAR1基因的多态性在阿司匹林抵抗中起着重要作用；

血小板膜糖蛋白IIIa基因由ITGB3基因编码，其外显子2第1565位氨基酸的突变(rs5918)，即T1565C(Leu59Pro)，分别决定了P1A1和P1A2两种等位基因，GP IIIa P1A2是阿司匹林抵抗主要基因，携带突变型P1A2等位基因患者行支架术后，其亚急性血栓事件发生率是P1A1纯合野生型患者的5倍，一般需要更高剂量的阿司匹林才能达到抗凝效果。

GP1BA别名GP1B(血小板糖蛋白1B基因)，该基因与阿司匹林相关的有两个SNP位点，其中rs6065(145Thr-Met)和阿司匹林的毒力相关，CC基因型，阿司匹林抵抗风险增加；CT和TT型，阿司匹林抵抗风险降低。

血小板内皮聚集受体1基因(PEAR1)是近年来发现的调控血小板功能的重要基因。PEAR1基因具有多个不同的SNP位点，可以影响血小板功能的主要有位rs2768759位点和rs12041331位点，其中rs12041331位点多态性是研究最多的与阿司匹林治疗反应性密切相关的多态性位点。rs12041331位点突变为G>A，在亚洲人群中的突变率显著高于其他人群，其中与GG纯合子相比，无论是单用阿司匹林还是阿司匹林联合氯吡格雷双抗治疗，A等位基因携带者的心血管事件风险及死亡率均明显升高。

综上，在使用阿司匹林前对阿司匹林抵抗基因多态性进行检测，针对患者基因型对患者进行疗效预测，并对高风险患者提前干预，以降低患者用药风险，具有很大意义。

目前临床上主要采取以下四种方式检测基因的多态性：

1.PCR-测序法

2.高分辨率溶解曲线法

3.芯片杂交法

4.Taqman-qPCR法

PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类阿司匹林抵抗基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中阿司匹林抵抗基因多态性进行检测。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：