[发明专利]一种青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法

说明书

本发明公开了一种青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法，包括：1)选取幼嫩青蒿叶片去除下表皮，得到除下表皮的青蒿叶片；2)将所述除下表皮的青蒿叶片置入酶解液中进行酶解，得到酶解混合液；3)将所述酶解混合液过滤离心得到原生质体沉淀，重悬后获得原生质体；4)将所述原生质体进行瞬时转化。本发明首次在青蒿中建立了原生质体分离及转化的方法，得到原生质体的产量为2.749×10⁵个/g FW，活力为96％，绿色荧光蛋白的转化效率为80％，获得的原生质体产量大，活力高。并且利用青蒿原生质体为受体进行转化，绿色荧光蛋白GFP、荧光素酶LUC及海参荧光素酶REN能够成功表达。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种青蒿叶片原生质体的分离和外源基因瞬时转化方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含多种次级代谢产物，如：青蒿素、青蒿酸、青蒿酮、β-石竹烯、β-法尼烯、大根香叶烯、α-蒎烯、樟脑、挥发油等。青蒿素(Artemisinin)是从青蒿叶片中分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。近年来，青蒿素及其衍生物被报道具有治疗红斑狼疮、阿兹海默症、肺结核、糖尿病、抗癌症和降血脂等功效。但是对于青蒿原生质体的分离和瞬时转化的研究尚属空白。

原生质体是指没有细胞壁包裹的植物细胞，由植物细胞的细胞膜、细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核组成。原生质体具有细胞全能性，可再生细胞壁，并且进行连续分裂，在特定激素刺激下可进行细胞分化，长成完整植株。

瞬时转化在分子生物学领域中应用广泛，包括蛋白的亚细胞定位，蛋白与蛋白间的相互作用，蛋白与启动子的相互作用等。受体材料选择的好坏是外源基因表达产物正确折叠、修饰并精确定位在相应亚细胞结构上的关键。成功用于瞬时转化的受体材料包括烟草下表皮、烟草BY-2细胞、叶肉原生质体和洋葱表皮细胞等。由于利用原生质体进行瞬时转化准确性更高，因此得到广泛应用。目前，拟南芥、烟草、水稻和小麦中原生质体分离和转化体系已经十分完善。但在本发明申请之前，尚无利用青蒿原生质体瞬时转化开展目的基因功能验证的报道，十分影响青蒿这一重要药用植物科研工作进展，所以建立适用于所研究物种的原生质体分离及转化体系十分重要。

因此，本领域的技术人员致力于探索并建立一种青蒿原生质体分离及瞬时转化的方法，建立适用于青蒿的原生质体分离及转化体系，促使青蒿在生产及科研工作中得到更广泛的应用。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是建立青蒿原生质体分离及瞬时转化体系。

为实现上述目的，本发明提供了一种青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法。

在本发明的较佳实施方式中，青蒿原生质体高效分离及瞬时转化的方法包括：

1)选取幼嫩青蒿叶片去除下表皮，得到除下表皮的青蒿叶片；

2)将所述除下表皮的青蒿叶片置入酶解液中进行酶解，得到酶解混合液；

3)将所述酶解混合液过滤离心得到原生质体沉淀，重悬后获得原生质体；

4)将所述原生质体进行瞬时转化。

进一步的，幼嫩青蒿叶片为2-3周生长健壮的青蒿叶片，采用胶带粘贴撕去下表皮。

优选的，此时青蒿苗条件为：每株小苗有4-6片叶子。

进一步的，酶解液配方为：1.65％纤维素酶R10，0.44％离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，pH 5.7的0.02mol/L MES，0.01mol/L氯化钙，0.1％BSA。