[发明专利]一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，包括以下步骤：

1）通过基因转染的方法，将靶向多肽基因转入真核细胞中，并通过靶向多肽基因中的信号肽将靶向多肽表达到细胞质膜上；所述的靶向多肽基因包括PreS1、GPC3、HA、VEGF、PD-1、PD-L1、Trail中的至少一种；

2）转染24h后，使用500～550µg /ml的G418，对转染的真核细胞进行筛选，每3～5天更换一次筛选培养基；筛选，至有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大；

3）挑取克隆团簇的细胞，胰酶消化后，将细胞通过有限稀释法接种到细胞培养皿中，加入200～250µg /ml的G418对细胞维持筛选；

4）待单克隆细胞增大后，将其扩大培养，并重复步骤（3）的有限稀释法进一步筛选稳定表达细胞株，经过多代的筛选获得能够稳定表达靶向多肽的细胞株；

5）取稳转细胞株进行扩大培养，挑选生长对数期的细胞，PBS洗涤3～5次之后，加入含有PMSF蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，充分浸润细胞；

6）将细胞收集起来，充分震荡细胞使其均匀分散，将细胞悬液置于1-5℃下旋转混悬，使细胞充分破裂形成大量细胞膜囊泡；

7）细胞混悬液在500～800×g下离心5～15min，将上清转移到新的离心管中，5000～8000×g下离心5～15min，最后将上清移到新的离心管，50000～80000×g下离心50～70min，移除上清，细胞膜沉淀用400～600ul缓冲液重悬，获得细胞膜囊泡，-80℃保存备用；

8）将溶瘤病毒与细胞膜囊泡混合均匀，混合液用脂质体挤压器在350-450nm孔径的薄膜下来回挤压不少于15回合，进而将薄膜换成150-250nm孔径薄膜，继续来回挤压不少于15回合，直至将溶瘤病毒颗粒装载进细胞膜囊泡的空腔里，形成尺寸均一的细胞膜囊泡包裹溶瘤病毒，-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，其特征在于:步骤1）所述的靶向多肽基因转染真核细胞的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染方法中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的真核细胞，包括MDCK细胞、VERO细胞、S2细胞、昆虫细胞、患者自体分离培养的细胞中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，其特征在于：步骤8）溶瘤病毒的种类包括溶瘤腺病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、新城病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、呼肠病毒、逆转录病毒中的至少一种。