[发明专利]鉴别四种天南星科药用植物的荧光PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种鉴别四种天南星科药用植物(天南星、半夏、虎掌、水半夏)的荧光PCR检测试剂盒及应用。鉴别四种天南星科药用植物的检测试剂盒，它包括天南星特异引物和特异探针，半夏属通用特异引物、半夏特异探针、虎掌特异探针，水半夏特异引物和特异探针，内标质控特异引物和特异探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑13所示。本发明以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，可以为解决目前中药市场天南星科植物使用混乱的现象提供科学可靠的方法。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种同时鉴别四种天南星科药用植物(天南星、半夏、虎掌、水半夏)的荧光PCR检测试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

天南星科植物含有生物碱类、苷类、氨基酸类、甾醇类、黄酮类和凝集素类等十余种有效化学成分，具有重要的药用价值。天南星、半夏、虎掌、水半夏皆为天南星科植物，其干燥块茎都有一定的药效。其中天南星和半夏收录在2015版中国药典中，而虎掌和水半夏不能当作药材天南星和药材半夏的基源植物。

天南星是天南星属的植物，入药称天南星ARISAEMATIS RHIZOMA，是天南星Arisaema erubescens(Wall.)Schott、异叶天南星Arisaema heterophyllum Bl.或东北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥块茎。其炮制加工品为制天南星。天南星有悠久的药用历史，具有散结消肿的功效，外用治痈肿、蛇虫咬伤。半夏PINELLIAE RHIZOMA是半夏属植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎。主要功能为燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结。根据炮制的不同，可分为法半夏、姜半夏和清半夏三种，其功效也有一定区别。法半夏偏重于燥湿健脾，清半夏长于化痰，姜半夏善于降逆止呕。虎掌是半夏属植物虎掌(虎掌南星或掌叶半夏)Pinellia Pedatisecta Schott.的干燥块茎，水半夏为犁头尖属植物鞭檐犁头尖Typhonium flagelliforme(Lodd.)BI.的干燥块茎。

虽然四种植物都属天南星科，也都有一定药用价值，但不论是在外观形态上，还是有效成分含量及药效上，四种药材存在差异，因此不能代替使用。然而在中药市场中，或因误种，或因图利，虎掌常与天南星或半夏混合出售。三者不仅价格相差较大，药效也不尽相同，损害了消费者的权益和身体健康，扰乱中药材市场秩序。而水半夏从药材到饮片的销售和使用过程中都存在与半夏混淆和替代的现象。值得注意的是天南星、半夏、虎掌和水半夏都有毒性，而且虎掌和水半夏的毒性比天南星和半夏的毒性高，误将虎掌和水半夏当做天南星和半夏使用，可能造成现用量过大，危及生命的事故。由此看出，中药材市场对天南星科药材规范科学鉴别的迫切需要。

目前常用的药材鉴定方法有组织鉴定、显微鉴定、光谱鉴定、色谱鉴定、分子生物学技术鉴定等，但是这些方法会存在感官检测局限性、准确性低、仪器配套成本高、鉴别操作复杂等问题。近年来实时荧光PCR技术检测的灵敏度、特异性和准确性，受到了很多研究领域的一致认可。本发明将该技术应用于这四种在市场上使用混乱的天南星科药用植物的鉴定中，可以为维护消费者权益和中药材市场秩序提供科学依据和有力保障。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种鉴别四种天南星科药用植物的荧光PCR检测试剂盒及应用。本发明的试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种鉴别四种天南星科药用植物的荧光PCR检测试剂盒，它包括天南星特异引物和特异探针，半夏属通用特异引物、半夏特异探针、虎掌特异探针，水半夏特异引物和特异探针，内标质控特异引物和特异探针，其中，

天南星特异上游引物TNXF：5’-AAGTGCGGGGTGAGGGAT-3’(SEQ ID NO.1)；