[发明专利]半滑舌鳎差异表达的microRNA标签及应用

权利要求书

1.半滑舌鳎精浆外泌体microRNA在半滑舌鳎性别鉴定中的应用，其特征在于所述microRNA性别标签为ssa-miR-27b-3p，其序列为TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC。

2.权利要求1所述microRNA性别标签的筛选方法， 如下：

1）精浆外泌体分离鉴定后，对半滑舌鳎精浆外泌体smallRNA进行测序分析，将 cleanreads 依次和 Rfam 数据库、cDNA 序列、物种重复序列库、miRBase 数据库对测序结果中的smallRNA 进行分类注释；将分类注释后的序列和 miRBase 数据库比对，进行已知microRNA 的统计；使用未注释上的序列进行新的 microRNA 预测，microRNA差异表达分析，差异表达miRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后与样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物；

2）将候选标签microRNAs按照以下四个标准进行过滤：（1）在两种样品中表达有极显著差异，即p值小于0.01；（2）与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；（3）两样品中至少有一个的TPM值大于10；（4）foldChange值大于4，所述foldChange值=TPM _{Sample_ZZ.} / TPM_{Sample_ZW}；

3）提取随机两组验证样本：经外周血染色体鉴定后的雄鱼及伪雄鱼精浆来源外泌体总RNA，利用Micro RNA定量分析试剂盒定量检测步骤2）过滤后的microRNAs的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到ssa-miR-27b-3p，其序列为TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC，此种标签在雄鱼样本中有高表达，而在伪雄鱼样本中表达量极低。